C放射免疫技术曾霞.ppt

免疫学教研室 曾霞 概念：利用多种标记技术与免疫学技术相结合而建立的分析技术体系。 特点：高度特异性，高度灵敏性 优点：重复性好、准确性高、操作简便、易 于商品化和自动化。 分类：固相测定，液体测定 标记免疫技术 按标记（示踪）物分类： 放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、 化学发光免疫技术、金免疫技术等。 放射免疫技术——是利用放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的免疫测定技术。 同位素 一、放射性核素 γ射线：主要为131I、125I、57Cr和60Co； β射线：主要有14C、3H和32P。 第一节 放射性核素与放射性标记物的制备 放射性核素的选择原则： （1）比活性（首要）。例如125I比活性为1.74×104Ci/g，14C比活性为4.5Ci/g，则1mol 125I或14C结合到抗原上，125I的敏感度约比14C大3900倍。 （2）合适的半衰期。 （3）易于标记：低能量的γ射线易于标记。 因而125I是目前常用的RIA标记物。 三、标记物的制备及鉴定 1.标记方法：标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。 （1）直接标记法：是将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸残基或组氨酸残基上。最常用的是氯胺T直接标记法。 优点：①操作简便；②标记物具有高度比放射性。 缺点：①只能用于标记含酪氨酸或组氨酸的化合物；②含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。 优点： ①可标记缺乏酪氨酸或组氨酸的肽类及某些蛋白质；②标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。 缺点：由于操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。 （2）间接标记法（又称连接法）：是以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。 （二）标记物的纯化 1.凝胶过滤法（分子筛） 2.离子交换层析法 3.PAGE 4.高效液相色谱法（HPLC） （三）标记物的鉴定 1.放射化学纯度：一般要求大于95％ 2.比放射活性：指单位质量标记物中所含的放射强度。用mCi/mg（或mCi/mmol）表示。比度越高，测定越敏感。 3.免疫活性：B/T在80％以上，该值越大，表示抗原损伤越少。 1959年 Yalow和Berson创建， 1977年 Yalow获诺贝尔奖金。 第二节 放射免疫分析 radioimmunoassay，RIA 显著特点：具有高度的敏感性（高达ng甚至pg水平） 、特异性和精确性，特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。 一、基本原理 标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）的竞争结合反应。 放射免疫分析——是以核素标记的抗原与受检标本中抗原竞争特异性抗体来测定待检样品中抗原含量的方法。为经典模式。 由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记免疫复合物的量就随着待检抗原的量而改变。 （二）实验方法 Ag* Ag Ab 反应条件 体积 温度 时间 pH 平衡法 非平衡法 ★抗原抗体反应 抗原抗体反应 如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（15～37℃）进行较短时间的温育，反之应在低温（4℃）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。 ★免疫复合物（B）与游离标记物（F）的分离 聚乙二醇沉淀法 双抗体法 双抗体-PEG法 是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。 晶体闪烁计数器包括了NaI闪烁晶体、光电倍增管以及计数器 测量的放射性信 号是仪器输出的 电脉冲数：每分钟计数(cpm) 计算 参数 cpm B/T (%) F/T (%) B/F (%) B/B0 (%) 拟合 注：T即是B与F的总和 标准曲线 放射强度测定 数据处理 IC中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。 Ag的量 反应式 B/F值 0 4Ag*+0Ag+3Ab3Ag*Ab+Ag* 3/1 2 4Ag*+2Ag+3Ab2Ag*Ab+1AgAb+2Ag*+1Ag 2/2 8 4Ag*+8Ag+3Ab1Ag*Ab+2AgAb+3Ag*+6Ag 1/3 免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）——是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析。 第二节　免疫放射分析 Ag-*Ab复合物的放射性强度与待测抗原的量成正比关系 （待测） （已知） 一、基本原理 单位点IRMA：（1）放射性核素标记的过量抗体+待测抗原，形成抗原抗体复合物；（2）反应平衡后，采用固相抗原结合反应液中剩余的未结合标