chapter++两水相萃取.ppt

7.4.3.2 盐的浓度 当pH6.9时，在PGE4000 8%及DX500的两相系统加入NaCl时，对蛋白质的分配产生很大的影响。 续 返回 结论： 加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。 当盐的浓度继续增加时，影响逐渐减弱，分配系数基本上无变化。 19.4.4 pH值 ①pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。 ②pH也影响磷酸盐的离解程度。 pH影响H2PO4-和HPO42-之间的比例，使U2-U1发生变化，从而影响K。 讨论：如何设计利用两水相技术测定两性物质的pI？ 在不同的盐系统中，生物大分子在pH=pI处，其K=K0相同。 19.4.5 温度 T影响相图，特别在临界点附近，尤为显著。因而影响K。 一般常温操作 ①节约冷冻费用。 ②室温下，μ较低，容易相分离。 ③成相聚合物对蛋白质有稳定作用。 19.4.6 荷电PEG作为成相聚合物 可以增大两相间的电位差。利用荷电PEG能产生较大的相间电位，能使分配系数增加。 全醪液分离技术 采用双水相技术就可以避免乳化 ,直接从醪液中提取。 细胞、细胞碎片和培养基中的不溶物对分配行为没有显著的影响 ,所以不同批次的发酵液可以取得几乎相同的结果。而且细胞和产物分离在两相 ,避免了胞内的降解酶类对产物的破坏作用。 补充：聚合物和盐的回收利用 缺点：由于反复的使用，PEG 相中可能含有大量的蛋白酶和其他杂质，这对目标产物的分离不利。 回收聚合物的方法：超滤法、离心法、清洗法、酶沉淀法和离子交换吸咐 法等。 盐的回收： 冷却盐相至低温，使得盐结晶析出，然后用离心或过滤等方法收集； 电渗析的方法回收盐类以及对PEG相除盐。 19.5应用 双水相系统的选择 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别，综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐，可选择性萃取目标产物。 要成功地运用两水相萃取的方法，应满足下列条件： 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率； 两相用离心机很容易分离。 双水相提取胞内酶的具体操作： 萃取：适量的细胞匀浆液与双水相体系（一般为PEG/盐）混合。 上下相的分离：在萃取达到平衡后，就必须使上下相分离。有两种方法：重力沉降和离心分离。 多聚物的分离：当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中，相与相分离后，在上相中加入盐，形成新的双水相体系，在适当的条件下，蛋白质重新被萃取进入盐相，而大量的PEG得到回收，盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。 返回 返回 返回 返回 返回 返回 两水相萃取的发展 1、低成本的双水相体系的开发 体系的成本较低，但已成功地应用于工业生产，但是体系中盐浓度高，无法实现亲和分配，并会破坏某些生物物质的活性，而使其应用范围受到限制。 DEX较贵，PEG/DEX难以工业化生产。 2、合成高聚物微粒与亲和凝胶微粒的应用 3、双水相体系同生物转化相结合 4、双水相萃取同生物分离技术结合 双水相萃取同膜分离技术结合 双水相萃取同细胞破碎相结合 双水相萃取同亲和层析相结合 返回 返回 返回 反胶束萃取（Reversed Micelles Extraction） 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚集体 微团和反微团 微团： 表面活性剂的极 性头朝外，疏水 的尾部朝内，中 间形成非极性的 “核” 水 非极性的“核” 极性“头” 非极性“尾” 反微团： 表面活性剂的极性头朝内，疏水 的尾部向外，中 间形成极性的“核” 有机溶剂 极性“头” 极性的“核” 非极性“尾” 反微团的优点 （1）极性“水核”具有较强的溶解能力。 （2）生物大分子由于具有较强的极性，可溶解于极性水核中，防止与外界有机溶剂接触，减少变性作用。 （3）由于“水核”的尺度效应，可以稳定蛋白质的立体结构，增加其结构的刚性，提高其反应性能。 因此，可作为酶固定化体系，用于水不溶性底物的生物催化 阴离子表面活性剂 AOT(二－（2－乙基己基）琥珀酸酯磺酸钠) 阳离子表面活性剂 季铵盐 构成反胶团的表面活性剂种类 * * * 双水相分配法 掌握：聚合物的不相溶性、相图含义（双节线、系线、临界点）。 了解：分配理论（表面能影响和电荷影响）、影响分配的参数 与有机溶剂萃取比较 含水量高（70～90%），是接近生理环境下操作。 分相时间短（特别是聚合物/盐系统）。自然分相时间一般为5～15