chapter++两水相萃取.ppt

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7.4.3.2 盐的浓度 当pH6.9时,在PGE4000 8%及DX500的两相系统加入NaCl时,对蛋白质的分配产生很大的影响。 续 返回 结论: 加入适当的盐类,会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。 当盐的浓度继续增加时,影响逐渐减弱,分配系数基本上无变化。 19.4.4 pH值 ①pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度,因而改变蛋白质所带电荷和分配系数。 ②pH也影响磷酸盐的离解程度。 pH影响H2PO4-和HPO42-之间的比例,使U2-U1发生变化,从而影响K。 讨论:如何设计利用两水相技术测定两性物质的pI? 在不同的盐系统中,生物大分子在pH=pI处,其K=K0相同。 19.4.5 温度 T影响相图,特别在临界点附近,尤为显著。因而影响K。 一般常温操作 ①节约冷冻费用。 ②室温下,μ较低,容易相分离。 ③成相聚合物对蛋白质有稳定作用。 19.4.6 荷电PEG作为成相聚合物 可以增大两相间的电位差。利用荷电PEG能产生较大的相间电位,能使分配系数增加。 全醪液分离技术 采用双水相技术就可以避免乳化 ,直接从醪液中提取。 细胞、细胞碎片和培养基中的不溶物对分配行为没有显著的影响 ,所以不同批次的发酵液可以取得几乎相同的结果。而且细胞和产物分离在两相 ,避免了胞内的降解酶类对产物的破坏作用。 补充:聚合物和盐的回收利用 缺点:由于反复的使用,PEG 相中可能含有大量的蛋白酶和其他杂质,这对目标产物的分离不利。 回收聚合物的方法:超滤法、离心法、清洗法、酶沉淀法和离子交换吸咐 法等。 盐的回收: 冷却盐相至低温,使得盐结晶析出,然后用离心或过滤等方法收集; 电渗析的方法回收盐类以及对PEG相除盐。 19.5应用 双水相系统的选择 根据目标蛋白质和共存杂质的表面疏水性、相对分子质量、等电点和表面电荷等性质上的差别,综合利用静电作用、疏水作用和添加适当种类和浓度的盐,可选择性萃取目标产物。 要成功地运用两水相萃取的方法,应满足下列条件: 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中; 酶的分配系数应足够大,使在一定的相体积比时,经过一次萃取,就能得到高的收率; 两相用离心机很容易分离。 双水相提取胞内酶的具体操作: 萃取:适量的细胞匀浆液与双水相体系(一般为PEG/盐)混合。 上下相的分离:在萃取达到平衡后,就必须使上下相分离。有两种方法:重力沉降和离心分离。 多聚物的分离:当目的蛋白是分配在PEG富集的上相中,相与相分离后,在上相中加入盐,形成新的双水相体系,在适当的条件下,蛋白质重新被萃取进入盐相,而大量的PEG得到回收,盐相中残余的PEG可用超滤或透析除去。 返回 返回 返回 返回 返回 返回 两水相萃取的发展 1、低成本的双水相体系的开发 体系的成本较低,但已成功地应用于工业生产,但是体系中盐浓度高,无法实现亲和分配,并会破坏某些生物物质的活性,而使其应用范围受到限制。 DEX较贵,PEG/DEX难以工业化生产。 2、合成高聚物微粒与亲和凝胶微粒的应用 3、双水相体系同生物转化相结合 4、双水相萃取同生物分离技术结合 双水相萃取同膜分离技术结合 双水相萃取同细胞破碎相结合 双水相萃取同亲和层析相结合 返回 返回 返回 反胶束萃取 (Reversed Micelles Extraction) 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时,表面活性剂会在水溶液中形成聚集体 微团和反微团 微团: 表面活性剂的极 性头朝外,疏水 的尾部朝内,中 间形成非极性的 “核” 水 非极性的“核” 极性“头” 非极性“尾” 反微团: 表面活性剂的极性头朝内,疏水 的尾部向外,中 间形成极性的“核” 有机溶剂 极性“头” 极性的“核” 非极性“尾” 反微团的优点 (1)极性“水核”具有较强的溶解能力。 (2)生物大分子由于具有较强的极性,可溶解于极性水核中,防止与外界有机溶剂接触,减少变性作用。 (3)由于“水核”的尺度效应,可以稳定蛋白质的立体结构,增加其结构的刚性,提高其反应性能。 因此,可作为酶固定化体系,用于水不溶性底物的生物催化 阴离子表面活性剂 AOT(二-(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠) 阳离子表面活性剂 季铵盐 构成反胶团的表面活性剂种类 * * * 双水相分配法 掌握:聚合物的不相溶性、相图含义(双节线、系线、临界点)。 了解:分配理论(表面能影响和电荷影响)、影响分配的参数 与有机溶剂萃取比较 含水量高(70~90%),是接近生理环境下操作。 分相时间短(特别是聚合物/盐系统)。自然分相时间一般为5~15

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