DNA重组(PCR技术).ppt

第二章 DNA重组 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 3.1 简史 PCR原理 PCR类似于DNA的天然复制过程 ，是模板DNA，引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）在一定条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应 其特异性取决于引物和模板的DNA的特异性结合 反应分三步进行：高温变性、低温退火、适温延伸为一个循环，约30~35个循环，2h左右将靶DNA扩增数百万倍。 引物 上游引物：与目的序列5’端相同 下游引物：与目的序列3’端互补 3.2PCR的过程 PCR模仿体内DNA复制，在体外由酶催化合成特异DNA片断 包括一系列重复的温度循环，每个循环包括3个步骤：高温变性、低温退火、适温延伸。 PCR过程 PCR过程 3.3 PCR反应体系 3.4 PCR产物的检测 3.5 PCR引物的设计原则 3.6 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA 3.7 PCR的应用 研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他…… 3.8 常用PCR的类型 反转录PCR 套式PCR（nested PCR） 反向PCR（inverse PCR） 锚定PCR（anchored PCR） …… DNA模板 DNA引物 dNTP TaqDNA聚合酶 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 3 高温变性 1 低温退火 2 重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 　　　　 　各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L 缓冲液 10× ddW 定容到一定体积 ① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ② 产物不能形成二级结构。 ③ 引物长度一般在16~30碱基之间。 ④ G+C含量在40%~60%之间。Tm为55℃ ⑤ 碱基要随机分布。 ⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧ 引物5′端可以修饰。 ⑨ 引物3′端不可修饰。 ⑩ 引物3′端要避开终止密码子的第3位。 DNAStar软件检查 * 1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… 1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶I的Klenow片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖 上游引物 下游引物 5’ 3’ 5’ 3’ dsDNA模板 待扩增片段 dsDNA模板 待扩增片段 根据序列信息设计一对引物 下游引物：与此序列反向互补 上游引物：与此序列相同 5’ 3’ 5’ 3’ PCR循环1 上游引物 Taq Taq dsDNA模板 下游引物 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 上游引物 Taq Taq Taq酶具有热稳定性 PCR循环1 双链分离成单链 95 ℃变性 第一个循环前，通常设定95 ℃变性5-10min，以利于模板充分变性。 下游引物 3’ 5’ 5’ 3’ 引物结合到单链模板上 Taq Taq PCR循环1 55 ℃退火 3’ 5’ 5’ 3’ Taq 酶结合到两条单链模板上 Taq Taq PCR循环1 55 ℃退火 3’ 5’ 5’ 3’ Taq Taq Taq酶按照5’→3’方向合成DNA PCR循环1 Taq酶复制DNA链 72 ℃延伸 3’ 5’ 5’ 3’ Taq Taq PCR循环1 Taq酶复制DNA链 Taq酶按照5’