HPLC固定相和流动相.ppt

一、液相色谱固定相 stationary phases of LC （一）吸附色谱固定相－硅胶 表面多孔型硅胶：30μm 无定形全多孔硅胶： 5~10μm n: 30,000 / m 优点：便宜、柱效高、载样量大 缺点：涡流扩散项大，柱渗透性差 球形全多孔硅胶：3~10μm 优点：便宜、柱效高、载样量大；涡流扩散项小，柱渗透性好 （二）分配色谱：化学键合固定相 2、按照键合的官能团分类 化学键合相固定相：Si—O—Si—C，Si—O—Si—N （1）非极性键合相- 反相HPLC 十八烷基（C18，ODS）、辛烷基（C8）、乙基、甲基、苯基等 流动相的极性大于固定液的极性 极性大的组分先出峰(tR小)，极性小的组分后出峰( tR大) （2）中等极性键合相 醚基键合相（ETH or ROR’）→正相or反相固定相，视流动相极性而定。 （3）极性键合相：-正相HPLC 氨基、氰基 流动相的极性小于固定液的极性 极性小的组分先出峰(tR小)，极性大的组分后出峰( tR大) （4）离子交换键合相 3、化学键合固定相的特点 4、分离原理 正相键合相色谱 固定相：极性键合相---极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN） 主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力 流动相极性增大，洗脱能力增强，组分的K值减小 反相键合相色谱 固定相：极性较小的键合相，苯基、烷基等 流动相溶剂的极性大于固定相 分离机理：疏溶剂作用理论：组分分子中的非极性部分与极性溶剂产生疏溶剂斥力，与键合相的疏水基团产生疏水缔合作用，产生保留作用；另一方面，组分分子中有极性官能团时，极性部分受到极性溶剂的作用，产生解缔作用并减小其保留作用。 疏溶剂缔合作用示意图 1.烷基键合相 2.溶剂膜 3.组分分子极性部分 4.组分分子非极性部分 决定组分保留值的因素（烷基键合固定相对组分分子的缔合作用和解缔作用能力之差）： ①组分分子结构对保留值的影响： 在反相键合相色谱中，以疏水结构差异为分离依据； 组分的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。 ②烷基键合固定相特性对保留值的影响： 固定相提供非极性作用表面，键合到硅胶表面的烷基数量决定组分k的大小。 碳链↑，疏水性↑，键合相的非极性作用的表面积↑ ，组分的保留值↑ ，选择性↑。 ③流动相性质对保留值的影响： 流动相的表面张力↑ ，介电常数↑ ，极性↑ ，此时组分与烷基键合相的缔合作用↑ ，流动相的洗脱强度↓，组分的保留值↑ 。 固定相 固定相代号：载体＋官能团 国产：YWG（液相、无定形、硅胶）、YQG（液 相、全多孔、硅胶）； 进口：Nucieosil C18， Zorbax-ODS （三）空间排阻分离固定相 （四）离子交换色谱分离固定相 二、液相色谱的流动相mobile phases of LC 对流动相溶剂的要求 流动相的选择原则 流动相的前处理 流动相的极性 不同色谱分离方法选用的流动相 溶剂的选择性 不同色谱模式流动相的选择 洗脱方式 （一）对流动相溶剂的要求 （二）流动相的选择原则 严格脱气 原因：流动相因溶解空气而形成气泡，从而造成： 进入检测器，出现噪音峰； 进入流路or色谱柱会使流速不稳，基线起伏； 溶解的O2会与一些溶剂产生有紫外吸收的化合物； 荧光检测中，溶解的氧会使某些成分荧光淬灭； 引起某些样品的氧化降解或溶液pH值变化。 脱气的方法： 超声振荡脱气、加热（多不用）、抽真空、惰性气体鼓泡吹扫（多用He）、在线真空脱气 过滤： 防止不溶物填塞流路和色谱柱 方法：0.45um的微孔滤膜：水相、有机相 （四）流动相的极性 反相HPLC中的溶剂优化 反相色谱—极性弱洗脱能力强，组分k减小 溶剂强度 通过改变混合流动相中的溶剂的相对比例，可以改变溶剂强度。流动相中水的比例减少，有机溶剂(如甲醇或乙腈)增加，溶剂强度增加，k值减少。 常用溶剂 甲醇or乙腈or四氢呋喃 + H2O 首先试用一种可能过强的流动相(如甲醇)，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k。当所有谱峰符合1＜k＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度) 反相色谱中 （六）溶剂的选择性 溶剂与组分分子之间的作用力： 色散作用、偶极作用、氢键作用、介电作用 溶剂的分类 根据分子间的作用力，把常用的溶剂分为8类： 处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；在分组三角形中相差较远的组中的溶剂，其选择性相差较大： 改善选择性 根据组分的性质，选择合适的溶剂。 利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。 （七）不同色谱模式流动相的选择 1、吸附色谱流动相 多用非极性烃类（加己