2.10 基因工程制药-基因工程药物的分离纯化.ppt

七、选择分离纯化方法的依据 1、根据产物表达形式来选择 分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化 前必须浓缩可用沉淀和超滤法。 产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表 达的一种形式，它可以避开可溶性表达蛋白和培养 基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化. 为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗 透压休克的方法来获得。 可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离 方法，或离子交换层析。 应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽 早采用高效的分离手段。 先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离 单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨 的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小 样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括 非蛋白类杂质）。 2、根据分离单元之间的衔接选择 随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲 和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效 果。 层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高 分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换 层析、亲和层析、凝胶过滤。 3、根据分离纯化工艺的要求来选择 分离纯化工艺应遵循以下原则： ⑴具有良好的稳定性和重复性； ⑵尽可能减少组成工艺的步骤； ⑶各技术步骤间要相互适应和协调； ⑷工艺过程中尽可能少用试剂； ⑸工艺所用时间要短； ⑹工艺和技术必须高效，收率高、易操作、能耗低； ⑺具有较高的安全性。 小 结 * * * * 呼伦贝尔学院 高 明 华 基因工程制药 基因工程药物的分离纯化 第十节 基因工程药物的分离纯化 基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物 都是多肽或蛋白质 。具有以下 特点： ①表达产物在初始料中含量较低； ②含有大量细胞及代谢产物； ③表达产物稳定性差，易失活变性； ④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异； ⑤应用面广，对其质量要求纯度高、无菌、无热原。 1、含目的产物的起始料的特点 基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、 纯化工艺有影响。包括： ①菌种的类型及其代谢特性； ②原材料培养基的来源及其质量； ③生产工艺及条件； ④初始物料的物理、化学和生物学性质。 一、建立分离纯化工艺的根据 2、物料中杂质的种类和性质 包括：相关性和非相关性杂质的含量、化学性质、结构、相对分子量、电荷分布、稳定性、溶解度等。 3、目的产物特性 包括：理化生性质，如结构、相对分子量、等电点、电荷分布、密度、溶解度、稳定性、疏水性、亲和性、配基等。 4、产品质量的要求 产品质量标准、用途、纯度、生物活性等 二 、分离纯化的基本过程 由于基因工程药物是从转化细胞、而不是从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也要高于传统产品。 基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。 基因工程药物分离纯化的一般流程 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包含体 细胞碎片分离 变 性 复 性 浓 缩 初步分离 高度纯化 制 剂 产 品 分离纯化的技术要求 ①技术条件温和能保持产物生物活性； ②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数； ③收率要高； ④两个技术间能直接衔接，不需要对物料加以处理； ⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。 三、细胞的破碎方法 细胞破碎（cell rupture）是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。 为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解细胞壁的组成和结构。 细胞壁的组成与结构 革兰氏 阳性细菌 革兰氏 阴性细菌 酵 母 霉 菌 植物细胞 壁厚(nm) 20~80 10~13 100~300 100~250 2~7μ m 层次 单层 多层 多层 多层 多层 主要组成 肽聚糖 多 糖 磷壁酸 蛋白质 脂多糖 肽聚糖 脂蛋白 脂多糖 磷 脂 蛋白质 葡聚糖 甘露聚糖 蛋白质 脂类 多聚糖 脂类 蛋白质 纤维素 半纤维素 果胶物质 木质素 蛋白质 破碎 难易程度 较难破碎 较易破碎 较难破碎 难破碎 很难破碎 细胞破碎技术的分类 分 类 破碎原理 破碎技术举例 物理 破碎法 固体剪切作用 珠磨法 、x-press法 液体剪切作用 高压匀浆 、超声破碎 化学 破碎法 溶胞作用 渗透冲击、增溶法 膜失水作用 脂溶法 生物破碎法 破坏细胞壁 酶溶法 自身酶的溶解 自溶 方法 技术 原理 效果 成本 举例 物 理 破 碎 法 匀浆法（片型） 细胞被搅拌器劈碎 适中 适中 动物组织及动物细胞 研磨法 细胞被研磨物磨碎 适中 便宜 超声