2各种PCR技术 二.ppt

PCR 技术 普通的PCR 在同一反应中用多组引物同时扩增几种 基因片段。如果基因的某一区段有缺失，则相应的电泳谱上这一区带就会消失 。复合 PCR主要用于同一病原体的分型及同时检 测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。 巢式PCR 先用一对靶序列的外引物扩增以提高模 板量．然后再用一对内引物扩增以得到特异 的PCR带，此为巢式PCR。若用一条外引物 作内引物则称之为半巢式PCR 为减少巢式PCR 的操作步骤可将外引 物设计得比内引物长些，且用量较少，同时在 第一次PCR时采用较高的退火温度而第二 次采用较低的退火温度．这样在第一次PCR 时，由于较高退火温度下内引物不能与模板 结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循 环，待外引物基本消耗尽，无需取出第一次 PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR 扩增。这不仅减少操作步骤，同时也降低了交 叉污染的机会 半定量PCR 利用普通PCR技术和仪器 其余和实时PCR一样 Applications 种质资源研究 品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定） 构建遗传连锁图 基因定位（QTL） 标记辅助选择 比较基因组研究 基因克隆（图位克隆） 生物起源、进化、医学及法医学 它是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基 因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生 DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只 能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于 构建基因组指纹图谱。 （特异引物） SSR（ Simple sequence Repeat ） =(microsatellite) =(Short Tandem Repeat,STR) Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在 主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。 Microsatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。 继RFLP之后的第二代分子标记 多态性好、重复好、共显性标记 特点 微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n， 植物（AT）n 微卫星DNA长度的多态性 微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列 原理 根据两端序列的保守性，设计引物；进行 PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序 列多态性。 其他 简单序列重复区间（Inter-simple Sequence Repeat, ISSR) 序列标记位点（Sequence-Tagged Sites,STS) 小卫星DNA（Minisatellite DNA) 单链构型多态性（Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP) 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) 三个步骤 (1)DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离 （四）基于DNA芯片技术的分子标记技术 核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 　　SNP标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷 酸的差异进行检测，SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每 1000 bp SNP 出现一次，已有2000多个标记定位于人类染色体，对人类基因组学研究具有重要意义。检测 SNP 的最佳方法是 DNA 芯片技术。SNP 被称为第三代 DNA 分子标记技术，随着 DNA 芯片技术的发展，其有望成为最重要最有效的分子标记技。 TaqMan法优缺点 Real-time PCR 方法应用 ?绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 ?相对定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同组织中的表达差异 药物疗效考核 耐药性研究