4 第四章 免疫荧光细胞化学技术.ppt

七、非特异性染色的产生及消除方法产生的原因： （1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。 （2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。 （3）组织中还可能存在类属抗原与相应抗体结合。 （4）制备的免疫血清中混杂抗其他组织成分的抗体。 （5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。 （6）荧光素不纯，标本固定不当等。  非特异性染色的消除方法 1 动物脏器粉末吸收法： 常用：肝粉（猪、鼠）、骨髓粉、鼠脑粉、鸡胚粉…… 原理：对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特异着色 方法：每毫升荧光抗体中加入肝粉50-100mg——混匀——4℃过夜——离 心——取上清——临用前加入荧光抗体进行吸收 2 透析法 原理：荧光素如FITC分子可通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可 将未结合的荧光素透析除去。 方法：将标记完毕的荧光蛋白液装入透析袋 浸入pH7.2-7.4的PBS中，4℃，每日更换3-4次PBS，约5-7天，透析液无荧光即可（荧光光源照射） 3 葡聚糖G-50柱层析法目的：除去游离荧光素 方法： 加入荧光抗体15-18ml---即将入柱时加PBS- --关闭下口30-40min---游离荧光素进入分 子筛孔氏加入洗脱液---荧光抗体向下移行 并与游离荧光素拉开距离---荧光抗体流出- ---前、中、后三部分收集，测F/P比值，合 并、浓缩、分装-----继续加入洗脱液，直 至洗脱液中无蛋白和荧光素止。 4 DEAE纤维素柱层析法 去除标记过多或过少荧光素的抗体分子 5 荧光抗体稀释法 6 纯化抗原方法 7 纯化抗体方法 8 伊文氏蓝衬染方法： 0.01%伊文氏蓝 + 0.01mol/LPH7.2PBS 稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色呈红色荧光，与特异性荧光成对比，减少非特异性荧光，宜作常规应用。 9 胰酶消化或10%牛血清蛋白封闭 八、 免疫荧光细胞化学的对照染色 为了排除某些非特异性染色，保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，必须在初次试验时进行以上对照试验，从而检测抗原与抗体的结合是否是特异的。常用对照如下： 阳性对照 阴性对照 自发荧光对照 1 阳性对照 用已知存在某相应抗原组织标本染色，结果为阳性 2 阴性对照 (1)吸收实验 用已知的相应抗原与标记的抗体反应，然后离心除去反应物，再用吸收过荧光抗体的液体与标本内抗原反应，结果应为阴性。 (2)抑制实验 用未标记荧光素的抗体与标本内相应靶抗原反应，然后再加入用荧光素标记的相同抗体进行染色反应，结果应为阴性。 ① 二步抑制法： 标本先加未标记的特异性抗体，再加标记荧光抗体。 ② 一步抑制法： 先将荧光抗体用未标记抗体作适量混合，再加在标本上染色。 效果较二步法好，并且简便。 (3)抗原对照 用确知不存在某相应抗原的标本染色。 (4)抗体对照 用与特异性抗体种属相同的动物正常血清或同一动物免疫前血清标记荧光素代替免疫血清。 3 自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS。 结 束 九、激光扫描共聚焦显微镜 LSCM 是80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品。 实现了对细胞内部非侵入式光学断层扫描成像，从而对被检物体样品从停留到表面单层，静态平面的观察进行到立体，断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用。 1 仪器构成  (1)计算机系统：控制着机械，光学、声学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光调节器。 (3) 显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共聚焦系统组成。 (4)检测系统，由检测器，检测放大器等元件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达 2 共聚焦成像原理 激光器发出的激光束经过光的扩束和整形，变成一束直径较大的平行光束，长通分色光镜使光束偏转90度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发出沿各个方向的荧光，一部分荧光经过物镜，长通分色反射镜，聚焦透镜，会聚在聚焦透镜的焦点外，经过焦点处的针孔，由检测器接收并转变成电信号。 3 光信号接收和成像方式 (1)光信号接收 生物样品发出的荧光通常有二种接收方式： ①由光电倍增管（PMT）把光信号转变成电信号； ②利用电荷耦合器（CCD）把光信号转变成电信号。 (2)成像方式