PCR、引物设计及逆转录PCR.ppt

4、G+C含量一般为40%-60% 引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。 G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。 G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。 引物设计的基本原则 5、Tm值之差应小于1℃，最适退火温度在55-60℃。 一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。 对于20bp左右的引物： Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C） 一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5℃左右。 引物设计的基本原则 6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3’端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。 引物设计的基本原则 7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身互补——发夹结构 引物之间互补——二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3’端的互补重叠。 引物设计的基本原则 8、引物的5’端可以修饰，3’端不可以修饰。 引物的5’端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。 由于延伸是从3’端开始的，所以不能进行任何修饰。 引物设计的基本原则 9、引物的3’端不可以A结尾。 引物3’端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3’端最好选择T。 引物设计的基本原则 10、引物3’端要避开密码子的第3位。 如扩增序列位于基因编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 引物设计的基本原则 1、避免重复碱基，尤其是G。 2、引物退火温度在58-60℃之间。3、G+C为30-80%。 4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。 5、引物的产物大小一般在80-250bp之间；80-150 bp最为合适（可以延长至300 bp）。  Real-Time PCR引物设计原则 6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。 7、Real-Time PCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNA污染影响。  Real-Time PCR引物设计原则 Primer Premier 5.0 Oligo 6 Primer 3（在线） Primer-BLAST（在线） 引物设计常用软件 File New DNA sequence 粘贴模板序列 引物有哪些信誉好的足球投注网站 引物位置 产物大小 引物长度 Primer BLAST PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。 PCR的基本原理 PCR扩增体系 模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以使细菌、组织样品等。 引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。 DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。 缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。 脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP。 Mg2+、K+、增强剂 1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95℃，30s）。 2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45～ 65℃，30s） 。 3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃，30 ～ 60s ）。 PCR的基本原理 高温变性 低温退火 中温延伸 理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。 实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106 ～ 107。 PCR扩增曲线 1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上有哪些信誉好的足球投注网站互补序列 ，并与特定位点杂交。 2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。 3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。 PCR扩增