PCR的来源及发展.ppt

医学分子生物学 PCR(Polymerase Chain Reaction) PCR 什么是PCR？ 聚合酶式反应（polymerase chain reaction，简称PCR），又称无 细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促反应扩增技术。 PCR的用途 扩增各种蛋白的基因：用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库 PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列 用于分子进化和种系发育的研究，因为在一些巨大分子的序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育是很有用的 分析和诊断遗传性疾病，根据其基因的缺失或突变对其做出诊断。如甲型血友病、苯丙酮酸尿症、地中海贫血等有特定的遗传性基因，可以做出明确的诊断 对人类HLA基因的多肽性分析，用于器官移植的配型。比原有的免疫学方法要好得多，无论在准确性及特异性，检测的速度等方面都提高了许多 PCR技术的发展史 第一代：手动/机械手式水浴箱基因扩增 三个水浴箱恒定三个温度，94° 58° 72° 优点：设备简单，投资少，与自动扩增仪相比无需升降温过程，实验 时间短，更接近理想PCR反应条件 第二代：自动化控制型定性基因扩增仪 与第一代水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分 无法对初始模板精确定量 无法实时监测扩增情况 跑胶繁琐，易污染 PCR技术的发展史 第三代：终点定量/半定量 第二代的定性PCR只能判断阴性阳性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能： 潜伏期病毒浓度探测 感染程度 致病病原体数量变化测定 抗病毒药物疗效评估 恢复期病毒载量检测 PCR技术的发展史 第四代：实时定量PCR 实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。 PCR结果的分析 thank you 泸医附院检验科 分子实验室：李宝林 缺点：实验人员劳动强度大，易疲劳而出差错，标本在移动过程中会暴露在空气下，温度受影响。而且有的地方由于气压水温无法达到94° PCR技术的发展史 PCR的基本原理 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 待扩增片段 高温变性 低温退火 中温延伸