乙型肝炎血清学和分子生物学检测技术.ppt

乙型肝炎病毒血清学和分子生物学检测技术 HBV基因型和基因变异研究： 必要性 主要方法 HBV-DNA病毒载量测定： PCR结合荧光探针技术 病毒复制水平最可靠，最直接的证据，与传染性和疾病进展密切相关； 主要用于HBV感染的判断，治疗适应症的选择及抗病毒疗效的判断。 HBV耐药突变的检测 ELISA检测实验室配备基本仪器 抗-HBcIgM 酶免检测 收样：血清标本 收样登记表： 抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表.doc（县级需检测） 慢性乙型肝炎血标本送检表.doc （县级不必检测） 样品整理、编号 样本保存：标本宜新鲜时检测，若5天内检测，可使用冰箱2～8℃保存，超过1周测定，应-20 ℃保存 检测项目：抗-HBc IgM 检测时限：每月10日前完成上月标本检测 检测试剂： 省统一购置，分次到省疾控免疫所肝炎实验室领取。 试剂储存： 2～8℃保存，注意效期 结果反馈 操作步骤 1、 平衡： 将试剂盒取出， 平衡至室温30min，微孔板开封后， 余者及时以自封袋封存。标本也需室温平衡30min 。 2、 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（ 如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1： 1 9 稀释后使用。 3、 编号： 将微孔条固定于支架， 按序编号，设阴阳性对照各2孔和空白对照1孔（双波长可不设空白孔）。 4、 稀释：将待测标本用生理盐水做1：1000稀释（质控品及阴阳性对照不稀释） 5、 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴阳性对照100ul， 6、 温育：封板、37℃温育30分钟。 7、 洗涤：5遍，最后1次尽量扣干 8、 加酶：每孔加酶标试剂100ul，空白孔除外 9、 温育：同步骤6 10、洗涤：同步骤7 11、显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，混匀， 37℃避光显色15min 12、测定：每孔加入终止液50ul，混匀，10min内测定结果。设酶标仪波长450nm（建议用双波长450/600-650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。 参考范围 阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值≤0.1（若有1孔阴性对照孔A值大于0.1应舍弃该空，弱两孔或以上阴性对照孔A值都大于0.1，应重复实验。 阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值≥0.8 结果判定 临界值（CUTOFF)计算：临界值=阴性对照孔A均值×2.1 阳性判定：样品A值≥临界值（CUTOFF)判为阳性 阴性判定：样品A值≤临界值（CUTOFF)判为阴性 注意事项 待测样品要求 冷冻样品实验前需溶解并混匀，使用前请将样品室温平衡30分钟以上。 如样品有杂质、浑浊现象，检测前应3500转/分离心5分钟，取上清液检测 续 待测样品1：1000稀释方法-非常关键 稀释液为0.9%生理盐水。 稀释方法:尽可能连续倍比稀释（1：10，连续3次） 不建议直接在1ml生理盐水中加入1μl血清,此种操作容易出现误差。 续 实验操作 严格按照标准操作步骤进行。 每次均需设阴性和阳性对照 原始记录： 完整的实验原始记录，如试剂批号，结果原始OD值，并保存好原始记录。 每次实验结束后，将结果及时填写在抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表.doc，注意表中请增加两点，试剂批号和结果原始S/CO值:s为标本OD值，CO为该批标本检测判定的临界值，二者的比值。 续 试剂使用 试剂在使用之前室温平衡30分钟。 国产试剂为定性试剂，不能作为定量试剂使用。 不同批次试剂最好不要混用。 一次检测未使用完的剩余试剂注意密封，保持干燥和洁净。 其它注意事项 避免在有挥发性物质及次氯酸类消毒剂（如84消毒液）的环境下操作。 加液时须用加样器，并经常校对加样器的准确性。加入不同样品或不同试剂组分时，应更换加样器吸头和加样槽。 封板膜不能重复使用，以防出现交叉污染。 所用样品，废液和废弃物都应按传染物处理，终止液为硫酸，使用时注意安全。 样本上送 县级送检到省级： 每月20日前，冷藏运送至省疾控中心病毒性肝炎实验室 标本： 未明确诊断慢性乙肝病例全部剩余血标本（县级需检测） 必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒 标本标记：用记号笔标记样本编号，最好再标记上姓名 标本送检表：《抗-HBc IgM 1:1000标本检测登记表》（含试剂批号和标本S/CO原始值），填写完整。 明确诊断为慢性乙肝者血标本（县级不必检测） 必须用2ml螺旋口血清保存管，按顺序放置于血清保存盒 标本标记：用记号笔标记样本编号，最好再标记上姓名 标本送检表：《慢性乙肝标本送检表》 标本量：约1ml，血量不足标本也要送检 标本复核 省级复核：定期按比例抽检 国家级复核：按照要求定期送国家疾控中心进行实验