BMFD-AM接触镜联合人表皮干细胞重建兔角膜上皮.pdf

叟主出叁鲎笪±鲎焦垒叁 ．． 堕生些堡丝笪壁全厶垂廛王垫堕重蕉丝鱼堕占廛 摘要与目录 BMFD．AM接触镜联合人表皮干细胞 重建兔角膜上皮 专 业： 眼科学 博士研究生： 万鹏霞 导 师： 王智崇教授 摘 要 目 的 stemcell 镜在角膜缘干细胞缺损(1imbal deficiency，LSCD)兔眼表注射人表皮干 细胞(Epi—SCs)单细胞悬液，观察并评价其重建角膜上皮的可行性、有效性和安 全性。 方 法 1．人表皮干细胞(Epi—SCs)的体外培养、纯化以及鉴定：取正常男性供体新 鲜皮肤组织，采用消化法和IV型胶原黏附法获得并分选人表皮干细胞，体外原代 培养。 2．原瓶粘附分选法获得20min快吸附的表皮干细胞，制备浓缩的人表皮干 细胞悬液(x107／m1)。利用激光共聚焦显微镜(Laserconfocal scanning 的表达，鉴定筛选所得的人表皮干细胞。 3．用机械刮除法制作雌性新西兰兔角膜上皮及角膜缘干细胞缺损动物模型 (n=60)并随机分为3组，每组20只： 制成的BMFD．AM接触镜联合表皮干细胞单细胞悬液注射行眼表干细胞移植： 叟主出叁鲎笪±鲎焦整叁 坠些鲎墅鱼壁垒厶耋廛王垫堕重蕉鱼鱼壁占廛 摘要与目录 BMFD·AM组：行BMFD-AM接触镜治疗； 空白对照组：单纯药物滴眼治疗。 4．术后局部滴含双抗的表皮细胞培养液4—6次，日，0．15％环孢素A眼液2 次，日，每晚结膜囊涂贝复舒(bFGF)眼膏。每3日更换羊膜，直至角膜完全上 皮化。每日裂隙灯下观察角膜上皮修复、角膜透明度、新生血管、炎症反应等并 评分，随访约2周。 5．病理组织及免疫组织化学检查：手术后当天，1天，3天、1周、2周，分 别取材进行冰冻切片，行HE染色和免疫组织化学染色(P63、Kl／10、K3／12、 K4、Pax6、MUC5AC) 6．Y-STR基因检测：术后2周标本行Y．STR基因检测。 forWindows1 7．数据采用SPSS 1．5统计软件处理，统计学方法为配对f 检验和单因素方差分析，以P0．05具有统计学显著性差异。 结 果 1、成功在体外无血清无饲养层培养体系下扩增原代人表皮干细胞，细胞呈 球形体积小，核质比高、细胞器少，细胞在显微镜下折光性强，胞体透亮。 2、Ⅳ型胶原黏附法联合原瓶黏附分选法筛选得到的表皮干细胞呈K15和K19 阳性，K1／K10阴性，并具有较强的增殖能力，传代后7天见细胞生长致密，体 积较小，核浆比例较大。 全上皮化，而另外两组角膜上皮修复迟缓，完全上皮化时间为：BMFD·AM组 纯羊膜治疗组及对照组问无统计学差异。 4、组织病理学(HE染色)显示细胞移植治疗后角膜上皮逐渐恢复正常复层 叟主出叁鲎簦主鲎焦叠叁 ． 坠坐蕉壁焦壁全厶壅鏖王塑堕重建鱼鱼堕土鏖 摘要与目录 结构。对照组上皮结膜化，出现杯状细胞，角膜基质胶原纤维增殖，新生血管增 生，炎症细胞浸润。 K4(+)、K3／K12(一)，为结膜上皮表型。 6、移植男性人表皮干细胞的雌兔角膜完全上皮化后，PCR检测到男性Y-STR 基因12个位点。 结 论 表皮干细胞是重建角膜上皮的理想种子细胞。BMFD-AM接触镜联合注射人 表皮干细胞单细胞悬液在兔角膜缘干细胞