FasL基因的克隆化及mRNA在肺癌组织中的表达分布.pdf

第‘章中文摘要 —————————————————————————————————————————————————————————————————————————————一一 中的表达分布 膊外科硕士研究生 彭传亮 指导老师 沈毅 中 文 摘 要 目的：通过采用反转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术利分子兜隆技术克 隆人FasL基凼片段，制备互补核糖核酸(cRNA)探针，采用原位杂交的方法 观察FasLmRNA在肺癌组织细胞中的表达分布情况，并探讨其临床意义。 RNABlood Mini 试剂盒(QIAamp kit)提取总RNA，特异性引物反转录制 备互补脱氧核糖核酸(eDNA)，聚合酶链反应扩增FasL摹闲片段，产物经琼 脂糖凝胶电泳，显示在z328bp处呈现l条与预期产物分子量大小相符的 物和质粒DNA两端互补，用T。连接酶将其定向克隆入质粒中，转化感受态大 肠杆菌JMl09，在涂抹有氨长青霉素的LB平扳上进行蓝臼筛选，获取有重组 质粒的阳性转化子，插入的FasLeDNA经DAN测序证实与GenebankfOFasL 序列相同，用Pstl酶酶切重组质粒，使之线性化，经SP6聚合酶体外转录制各 地高辛标记的FasL cRNA)。收集青岛大学医学院附属 cRNA探针(Dig．FasL 医院胸外科手术切除的肺癌新鲜标本(经病理证实，其中鳞状细胞癌3例，腺 癌2例，小细胞癌1例)，置于无菌ED管中，经液氮速冻运输，转移至一70 ℃冰箱中备用，标本经4％多聚甲醛和15％蔗糖处理后制备成冰冻切片，厚度 为69m，再经多聚甲醛后固定，非离子型去污剂处理细胞膜，在切片上用 cRNA探针进行原位杂交，经网唑氮蓝(NBT／BCIP)显色，镜下观察 FasLmRNA在肺癌细胞中的表达分布情况。 结果：DNA测序证实重组质粒中插入的FasL eDNA序列准确允误；地高 卒标记的FasL cRNA探针经标记效率检测，标记效率满意；镜下观察发现三种 病理类型的肺癌细胞胞浆中均可检测到蓝紫色杂交信号，表明肺癌细胞中存在 FasL mRNA的表达。 第一章。{J文摘要 结论：FasL基因的克隆化成为肺癌细胞凋￡：研究的工具；地高辛标记的 FasL mRNA探针为进一步研究FasLmRNA在肺癌细胞中的表达分布提供r 有效手段；FasL作为促细胞凋l=基凶与肺癌的发生、发展有重要关系。 关键词FasL基困；cRNA探针；肺癌细胞；原位杂交 垫二至墨窒塑墨————一 ofits thedistribution FasL and of clone The gene cell in cancer mRNA lung Abstract