流式细胞技术及图像处理.ppt

同型（isotypes）抗体主要有：免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白E（IgE）和免疫球蛋白D（IgD）。 * 假三维图和三维图 SSC-Height FSC-Height Counts SSC → CD45 → CD14 → 等高图和密度图 等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。 密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。 设门与数据分析 门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。 椭圆形 圆形 十字门 线性门 流式分选 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、培养板) lasers 断裂点(充电) 高压偏转板 第二节  流式细胞术的科研应用 分析群体细胞 所需时间短 多参数分析 定性或定量 流式应用常见范围 细胞大小 细胞的颗粒度 细胞表面分子：CD 系列等 细胞浆内分子：胞内细胞因子等 细胞核内分子：P53 细胞功能检测：细胞周期、凋亡、PH、Ca++、细胞活性等 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 实验标本的处理 单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体 细胞染色 染色要求： 特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群 非特异反应水平低 抗体效价高，用量适用于常规标本 使用特异的单克隆抗体 最好使用荧光直接标记的抗体 采用适当的阴性对照物 抗体最适滴度 抗体的选择 首选直接标记抗体 荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适 合弱抗原的检测 实验对照的设计 空白对照：ALL 阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围 常用同型抗体对照 单色分析：设阴性对照（或同型抗体对照） 多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照 （用于仪器校正），补偿调整管 阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含量。（特别在检测阴性时） 流式检测应用实例 细胞表面、细胞内分子检测 细胞周期分析 细胞凋亡分析 淋巴细胞表面抗原分析 样本来源 新鲜抗凝全血 PBMC 单克隆荧光抗体染色 溶血 洗细胞 固定 上机检测 淋巴细胞细胞内抗原分析 样本来源 新鲜抗凝全血 PBMC 细胞表面抗体染色 溶血、固定 细胞打孔 细胞内抗体染色 上机检测 细胞周期分析： G1 M G2 S Quiescent cells G0 处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同，G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA含量处于二倍体和四倍体量之间。 DNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例。 样品制备 1000rpm 5分钟 收集2X106个细胞 PBS漂洗 两次 70%酒精 4度固定过夜 收集固定的细胞 PBS漂洗 PBS 悬浮细胞 2.5μl 10μg/μl RNase A 37℃消化1小时 过300目细胞筛 50μl 0.1mg/ml PI（含1%Triton)， 1000rpm5分钟 离心 两次 混匀，室温 静止5分钟 上机 DNA 流式检测的主要指标 DNA 含量: ploidy：细胞内染色体DNA含量 DI：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细 胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性 PI：增殖细胞占总周期细胞的比例 CV： G0/G1期细胞DNA含量变异系数 Annexin V Assay （建议用于悬浮细胞） 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡，可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。 在Ca2+存在时，Annexin V 与PS