聚乙二醇化重组人白细胞介素-6的放射性标记分离纯化与生物学活性鉴定.pdf

中文摘要 白细胞介素．6(IL．6)是淋巴类及非淋巴类细胞产生的一种多功能细胞因子，在 机体免疫、骨髓造血及炎症反应中均能发挥重要作用，是细胞网络中的重要成员。目 前以IL一6治疗血小板减少症为目的的研究，在欧美和日本已进入临床试验阶段。但 IL．6在体内由于蛋白酶的水解而呈现出低稳定性，同时由于快速的肾排泄和广泛的组 织分布其生物半衰期很短。为了达到期望中的临床效果，通常采用高剂量和频繁给药； 同时由于其具有广泛的生物学效应，可能产生副作用。 有关研究发现，IL．6经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过减少；PEG的 屏障作用保护了IL．6不易被蛋白酶水解，同时减少了抗体的产生，这些均有助于IL．6 循环半衰期的延长，并保证它促进血小板生成的临床效果。我国有关单位开发的 PEG．rhlL一6新型药物也J下处于『临床前研究阶段。同位素标记示踪法是目前生物技术药 物临床前药代动力学研究的主要手段之一，而制备高纯度的同位素标记物是应用该方 法进行药代动力学研究的关键和首要条件之一。为使PEG—rhIL一6早同应用于临床， 本研究制备出高纯度，比放射性适中，生物活性保持良好的PEG．rhlL一6同位素标记 物，为进一步研究PEG—rhlL一6在体内的代谢规律提供必要条件和保证。 本研究选用碘一J25作为标记核素，采用双相氯氨T法和常规氯氨T法对聚乙二 醇化重组人白细胞介素一6(PEG．rhlL．6)进行放射性碘标记，比较两种方法的标记率、 比放射性和对蛋白质生物活性影响；分别用凝胶过滤法和离心超滤法对标记物分离纯 化，同时用三氯乙酸沉淀法和SDS．PAGE电泳法鉴定纯化后标记物的放化纯度；采 度和保护蛋白对标记蛋白的储存稳定性影响。得到的结果如下： 13×l 射性为5．5 05Bq／ug。三氯乙酸沉淀法鉴定经过柱层析和超滤离心纯化后标记物 的放化纯度99％，SDS—PAGE法鉴定标记物与标准品电泳行为一致，有两个电泳条 带，Rf值分别为0．289和O．542。 射性为4．625×105Bq／ug，三氯乙酸沉淀法鉴定柱层析和超滤离心纯化后标记物的放 化纯度99％，SDS．PAGE法鉴定标记物与标准品电泳行为比较，有三个电泳条带， 比标准品多了～条Rf值为O．214的蛋白条带，说明标记物在该法标记时受到部分损 伤，可能产生了聚合物。 3．离心超滤法纯化双相氯氨T法标记蛋白，与通常应用的凝胶过滤纯化法进行 比较。结果离心超滤法得到的蛋白回收率为92％，而凝胶过滤法得到的蛋白回收率仅 4．MTT比色法测定两种方法进行碘标记PEG．rhlL。6的生物学活性。与标准品相 比，常规氯氨T法标记物生物活性有所降低，而双相氯氨T法标记物活性基本保持。 5．温度和保护蛋白对双相氯氨T法进行碘标记PEG-rhlL一6的稳定性有明显影 天后用TCA方法测定放化纯度，放化纯度分别下降至90％以下：加保护蛋白的标记 物在相同温度保存条件下延长lO．15天仍能保证90％以上的放化纯度。标记物稳定性 保持良好。 结论： 1．双相氯氨T法与常规氯氨T法对PEG．rhlL．6进行放射性碘标记比较，有反应 温和，标记充分，条件易于控制的优点，能达到较高的标记率和比放射性，对生物活 性影响小。 2．离心超滤法用于双相氯氨T法标记物的纯化，具有快速、简单、蛋白回收率 高的优点，得到的标记物浓度高且不影响蛋白的生物学活性。 3．用双相氯氨T方法标汜得到的标记物在低温和有保护蛋白条件下可储存时间 较长，性质稳定，适合用于示踪动力学的研究。 human Radio of Recombinantinterleukin-6 Polyethyleneglycol Labeling PurificationandIdentificationoftheLabeled (PEG—rhlL一6)，the PEG-rhIL-6 Xu Xiankun(Biophysies) Directed