抗体化PDTRP基因免疫诱导的抗肿瘤效应及其GM-CSF增强作用分析.pdf

抗体化PDTRP基因免疫诱导的抗肿癯效应及GM-CSF增强作用的研究 中文摘要 中文摘要 抗体化PDTRP基因免疫诱导的抗肿瘤效应及GM．CSF增强作 用的研究 1 关键词：MUCGM．CSF基因免疫肿瘤疫苗 MUC 1是一种广泛分布于腺上皮细胞的跨膜糖蛋白，在正常细胞和肿瘤细 l在正常细胞和肿瘤细胞上的表达方式存在差异。这种 胞上均有表达，但MUC 差异主要表现在糖基化的不同，分布于正常细胞表面MUCl的O一连接糖链遮盖 了MUC l中的关键序列——串联重复序列(姗s)中的PDTRP残基，而肿 瘤细胞表面的MUCI的0．连接糖链较短，未能遮盖PDTRP序列，暴露的这一 序列就成为肿瘤靶抗原．诱导针对肿瘤特异性PDTRP的免疫应答，产生有效的 抗肿瘤效应。所以，PDTRP这一残基序列是MUCl肿瘤疫苗的最佳候选。由于 PDTRP分子量小，直接将PDTRP或以串联表位方式作为疫苗，难以诱生有效的 1为靶点的肿瘤生物治疗 免疫应答。因此，探索一种有效的肿瘤疫苗是以MUC 的关键。以往的研究表明，以免疫球蛋白作为抗原载体，将抗原表位克隆于免疫 球蛋白的互补决定区(CDRs)，使抗原表位具有一定的抗原分子量并保持其在 CDRs上的空间构象。用此抗体化抗原表位基因免疫小鼠，能有效地诱导小鼠产 生针对此抗原表位的特异性体液免疫和细胞免疫应答。因此，我们设想，将肿瘤 抗原表位PDTRP插入免疫球蛋白CDRs，构建抗体化PDTRP并基因免疫小鼠， 诱导机体的特异性抗肿瘤免疫应答。在此基础上，进～步以细胞因子GM-CSF 作为免疫分子佐剂，柯建含肿瘤抗原表位和GM-CSF基因的重组质粒，增强抗 PDTRP的肿瘤免疫效应。基于上述设想．我们进行了以下研究： 1．抗原表位PDTRP抗体化的分子设计及抗体化PDTRP重组质粒的构建、鉴 定和体外表达 为了解抗原表位PDTRP串联后是否会导致其空间构象的改变，我们利用计 算机模拟的方法，对三串联的抗原表位PDTRP与MUC1串联重复序列(VNTRs) 中的多肽序列进行分析，比较两者差异。结果显示抗原表位PDTRP串联后的空 间构象成环状，总势能为．813．26KJ／M，将三串联抗原表位PDTRP与MUCl核 心序列拟合后黜“铲1．03，提示抗原表位PDTRP串联后没有明显改变表位空间 构象。为证实在重链CDR5插入抗原表位不会影响免疫球蛋白空间构象，我们分 CDR3的亲、琉水性及抗原性，结果显示：抗原表位 析了71neo和ylneo-PDTRP 蔓且大芈曩士论文 抗体化PDTRP基因免疫诱导的抗舯癯效应及(3M-CSF增强作甩的研究 中文摘要 的插入未影响CDR3的构象和抗原性。 酶EcoRI消化后，回收免疫球蛋白重链可交区片段，并将此片段定向克隆到编 码免疫球蛋白重链恒定区质粒ylneo中，构建完整的免疫球蛋白重链编码质粒 ylneo．PDTRP，通过酶切鉴定及测序后证明其构建正确。进一步，为了解重组质 淋巴瘤细胞株JS58L，ELISA的方法检测转染上清中免疫球蛋白IgG的水平。结 果表明：体外转染J558L24小时后，细胞上清孛fgG的表达量为5．03ng／m!，高 表达时间至少持续48小时。 2．抗体化PDTRP基因免疫诱导的特异性免疫应答和抗肿瘤效应 为研究抗体化PDTRP基因免疫后能否诱导特异性免疫应答，我们首先检测 了抗体化PDTRP基因免疫诱生的血清特异性IgG抗体。由于我们的前期实验已 经证实，71neo系列质粒免疫的最佳途径是经脬免疫，所以，我们首选脾基因免 疫，然后以肌肉免疫加强。即将重组质粒-flneo-PDTRP于第0周经脾基因免疫小 鼠，空质粒载体和生理盐水作为阴性对照，第4周经肌肉基因免疫加强。免疫后 抗体水平。结果显示：与对照组比较，1，1neo-PDTRP免疫组小鼠血清在第l周 即能检测到特异性抗PDTRP抗体的表达(P／N=2．51)，血清中抗体水平到第