日本沼虾卵巢表达序列标签分析及生殖相关基因克隆和表达.docVIP

日本沼虾卵巢表达序列标签分析及生殖相关基因的克隆与表达 【摘要】：生殖细胞的发生是发育生物学研究的主要内容之一,卵子在卵巢中的形成更是个体发育中极其重要的时期,也是历来备受关注的生殖生物学课题。与其它模式生物相比,十足类中关于生殖的分子机制方面的研究相对薄弱,淡水虾类尤其突出,迄今对淡水虾类遗传资源的了解极为有限,NCBI数据库中收录的信息量与对虾类相比颇为匮乏。因此,大量挖掘、获取淡水虾类生殖相关的基因资源,无疑具有重要的意义和潜在的应用价值。同时,一些功能保守基因的发现,也为遗传背景薄弱的经济物种生殖细胞的研究带来了契机。本文以日本沼虾为研究对象,通过构建卵巢cDNA文库及表达序列标签分析,鉴别了29个与生殖、发育相关的基因;随后以日本沼虾卵巢发育过程为主线,以获得的表达序列标签为基础,结合同源克隆策略,分离获得了7个与卵母细胞形成、成熟有关的基因,并对其序列特征和时空表达进行了系统地分析。研究主要包括如下四个部分:1、日本沼虾卵巢cDNA文库的构建及生殖相关基因的鉴别为了研究日本沼虾卵巢发育过程中储存的遗传信息,以卵巢为材料构建了cDNA文库,文库重组率为82.93%,库容量为2.9×10~6,插入片段大小为0.5-3kb。随机挑取文库中3294个克隆进行5’-3’端测序,获得了3256条高质量的表达序列标签(ESTs),拼接后得到了1514条单基因簇,其中可推测功能的序列占47.5%。据序列相似性分析,发现了组织蛋白酶B和L、细胞周期蛋白B、周期蛋白依赖性激酶、DEAD-box家族蛋白等29个与生殖、发育相关的基因。此外,在构建的文库中还发现了与皮质棒形成密切相关的围食膜因子,预测在成熟卵缺少皮质棒结构的沼虾属种类中,这种基因同样存在。通过卵巢cDNA文库的构建及ESTs分析,初步明晰了与日本沼虾卵巢发育相关的基因,为进一步研究日本沼虾乃至十足类的功能基因组提供了重要的基础资料。2、日本沼虾DExD-box家族基因的分子克隆、特征分析及时空表达根据ESTs提供的信息,结合同源克隆策略,采用RACE技术成功克隆了以vasa为代表的DExD-box家族4个基因的全长cDNA序列。从日本沼虾卵巢中克隆得到的DExD-box基因Mn-vasa、Mn-p68和PutativeMn-DDX39cDNA全长分别为2391、2174和1774bp,开放阅读框分别为1806、1623和1299bp,编码601、540和432个氨基酸的蛋白。其中PL10基因的RNA存在选择性剪接,得到Mn-PL10A、Mn-PL10B两种转录本,两者cDNA全长分别为2277和2649bp,开放阅读框分别编码485和709个氨基酸的蛋白,前者比后者在N端缺少224个氨基酸。所推测的5种蛋白均具有DExD-box家族特有的9个保守结构域和GG重复序列,并且在Q-motif上游17个氨基酸处除Mn-PL10A外都存在一高度保守的苯丙氨酸(F)。RT-PCR的研究结果表明,Mn-vasa基因仅在日本沼虾性腺中表达,并且在卵巢发育的增殖期表达量最高,此后随着发育进程逐渐下降,至消退期下调至最低。除Mn-vasa外,DExD-box家族的另外3个基因Mn-PL10、Mn-p68、PutativeMn-DDX39在日本沼虾组织中广泛分布,但都表现出在卵巢和肝胰腺中高表达的特征。它们在卵巢发育中的表达模式基本相似,都表现为消退期降至最低、次级卵黄发生期上调至最高。对日本沼虾DExD-box家族基因的研究结果表明,Mn-PL10基因的RNA存在选择性剪接,推测其属于通过选择启动子形成不同转录本的选择性剪接方式;Mn-vasa、Mn-PL10、Mn-p68和PutativeMn-DDX39基因在结构上高度保守,这些保守结构的存在保证了其功能的实施;Mn-vasa基因的主要作用可能体现在卵原细胞的形成上,而Mn-PL10、Mn-p68和PutativeMn-DDX39则可能在日本沼虾卵母细胞的成熟过程中具有调节作用。3、日本沼虾成熟促进因子(MPF)组成亚基基因的分子克隆、特征分析及时空表达成熟促进因子(MPF)由调节亚基周期蛋白B(cyclinB)和催化亚基细胞周期蛋白依赖性激酶(p34~(cdc2))构成。从日本沼虾卵巢中克隆得到的Mn-cyclinB基因和Mn-Cdc2基因cDNA全长分别为2318和1639bp,开放阅读框分别编码398和299个氨基酸的蛋白。Mn-cyclinB具有989bp偏长的3’UTR,其中集中了包括2个多聚腺苷酸加尾信号、5个胞质聚腺苷化元件(CPEs)、1个翻译调控元件(TCE)和1个K-box在内的多种调节元件。Mn-cyclinB蛋白具有周期蛋白B特有的破坏框、周期蛋白识别框和磷酸化位点。进一步的多序列比对和同源性分析表明日本沼虾Mn