2003、真题解析1、简述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得基本原理.docVIP

2003、真题解析 1、简述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得基本原理，你使用该技术分离和检测过何种物质？主要操作步骤有哪些？ 该题是实验操作中的常考题 SDS－PAGE：当SDS与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，从而天然蛋白质分子间的电荷差别。与此同时蛋白质在SDS的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS -蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，反映了分子量的差异。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS的基本操作和聚丙烯酰胺凝胶电泳相近，其支持介质都是聚丙烯酰胺凝胶，因此在制胶、加样和电泳仪器都都相同或相近，区别的是SDS需要有标准蛋白溶液及供试品溶液的制备取标准蛋白，加水制成每1ml中含2～5mg的溶液，与水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸钠0.04g，溶于40ml水中)1∶3混合，置冰箱中过夜。供试品照上述方法配制相对迁移率和分子量计算 将电泳脱色后的区带用卡尺或用扫描定位法测量染料移动的距离、染色前胶条长度、蛋白移动距离和脱色后的胶条长度。大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法） DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。 1.????? 取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥； 2.????? 将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA pH 8.0，25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中，剧烈振荡； 3.????? 加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中； 4.????? 加入150 μl预冷溶液III(每100 ml 的溶液III中含60 ml 5 mol/L 乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5 ml H2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； 5.????? 在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管； 6.????? 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟； 7.????? 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽； 8.????? 加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解； 9.????? 用0.5μl的RNase 37℃温育5~10分钟； 10.? 电泳鉴定。 3、谈谈你所了解的生物化学近年来的新进展。 自己发挥，比如：蛋白质结构与功能，RNA领域（RNA干扰），酶工程，分子病和遗传病的研究等等。 没有再出过，相当于送分题 4、DNA双螺旋模型是哪年由谁提出的？请简述其基本内容。为什么说该模型的提出是分子生物学发展史上的里程碑，具有划时代的贡献？ DNA的双螺旋结构模型是在1953年由Watson和Crick两个人提出的。 按Watson-Crick模型，DNA的结构特点有：两条反相平行的多核苷酸链围绕同一中心轴互绕；碱基位于结构的内侧，而亲水的糖磷酸主链位于螺旋的外侧，通过磷酸二酯键相连，形成核酸的骨架；碱基平面与轴垂直，糖环平面则与轴平行。两条链皆为右手螺旋；双螺旋的直径为2nm，碱基堆积距离为0.34nm，两核酸之间的夹角是36°，每对螺旋由10对碱基组成；碱基按A=T，G≡C配对互补，彼此以氢键相连系。维持DNA结构稳定的力量主要是碱基堆积力；双螺旋结构表面有两条螺形凹沟，一大一小。 DNA双螺旋结构的提出开始, 标志着生物科学的发展进入了分子生物学阶段.分子生物学使生物大分子的研究进入一个新的阶段,使遗传的研究深入到分子层次,生命之