第四章、药物定量分析与分析方法验证.ppt

第四章 药物定量分析与分析方法验证Quantitative Analysis and Analytical Method Validation 样品处理步骤与分析方法选择 分离、净化和浓集 提取法：液-液提取、液-固提取 液-液提取：选与水不相混溶的有机溶剂进行提取。 提取的关键性问题：提取的选择性和提取率的重复性。 影响提取的因素主要有：水相pH、提取溶剂、离子强度。 固相萃取步骤（以反相柱为例） 活化：6-10倍体积的甲醇或乙腈润洗填料，使其溶剂化；6-10倍体积的水或缓冲液冲洗柱子，使其达到良好的吸附分离状态； 上样：将样品加到柱子上，用抽真空或加压的方法，让样品缓缓通过萃取柱。 净化分离：用适当溶剂洗涤，使感兴趣化合物保留在柱子上，洗除杂质，达到净化目的。 洗脱：改变洗脱剂的极性 和（或）pH，使待测物从柱上解吸，收集洗脱液。 被测组分的浓集 化学衍生化 三、体内样品分析方法与方法验证 思考题 1.常用生物样本有哪些？如何获得？ 2.生物样品测定前为什么要除去蛋白质？除去蛋白质的方法有哪些？ 3.定量分析方法验证指标有哪些？ 燃烧分解 O2 HBr + S2- + SO42- + … HBr + S2- NaBr + Na2SO4 + H2O NaOH, H2O2 Br- + Ag + AgBr 剩余的Ag+ + SCN- AgSCN 例 磺溴酞钠的含量测定 Ch.P (2010) 例 碘苯酯的含量测定 Ch.P（2010） 碘苯酯 I 原理 碘苯酯系有机碘化物，用氧瓶燃烧分解，转变为碘化物，继而氧化为游离的碘，并被定量地吸收于吸收液中，和氢氧化钠反应，生成碘化物与碘酸盐，加入溴-醋酸溶液，使全部转变为碘酸盐，过量的溴以甲酸及通空气去除。加入碘化钾，使与碘酸盐反应析出游离碘，用硫代硫酸钠液滴定，碘与淀粉结合所显的蓝色消失即为终点. 滴定度的计算 放大反应 I2 + NaOH→NaIO+NaI 3NaIO→NaIO3+2NaI NaI+3Br2+3H2O→ NaIO3 + 6HBr IO3- + 5I- + 6H+→3I2 + 3H2O I2+ 2S2O32-→2I-+S4O62- 1mol碘苯酯→3 mol I2 →6 molNa2S2O3 反应摩尔比为1∶6 思考题 试述氧瓶燃烧法和凯氏定氮法的原理以及两法的异同。 若用氧瓶燃烧后碘量法测定泛影酸含量，每1 mLNa2S2O3滴定液（0.02 mol/L）相当于多少毫克的泛影酸？ C O O H I N H C O C H 3 I I H 3 C O C H N 泛影酸 第五章 体内药物分析 一、常用生物样品的种类、采集和贮藏 血样 血浆(plasma) 血清(serum) 全血(whole blood) 全血+抗凝剂(肝素) 离心 上清液 全血 离心 上清液 全血+抗凝剂(肝素) 混合 注意：采血后应尽快(≤24 h)分离出血浆、血清，再冰冻保存(-20 oC). 尿液(Urine) 收集服药后一定时间内(8 h、12 h、24 h)尿样，记录体积，混匀后取一定量，测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累积量。 尿中药物浓度变化较大，其变化不能直接反映血液中药物浓度，因此两者相关性较差。 尿中药物以原型、代谢物或缀合物形式存在。主要用于药物剂量回收，肾清除率，代谢类型研究及人群代谢分型研究。 尿液主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，短期(24-36 h)保存可置4 oC冷藏或加防腐剂(如甲苯、氯仿、浓盐酸等)，若长期保存则需冷冻保存。 唾液(Saliva) 漱口15 min后收集口内自然流出或经舌尖在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清。 唾液采集不受时间、地点限制，容易反复采集，采集时患者无痛苦。 唾液组成受各种因素影响，个体差异大，与血浆药物浓度相比，唾液中药物浓度变化不大，且浓度较低。但部分药物在血浆中的游离药物浓度与唾液中浓度相当。因此，可由唾液中药物浓度推断血浆中药物浓度。 组织 头发 二、生物样品分析前处理技术 考虑的因素： 药物的理化性质（酸碱性、亲脂性、挥发性、UV吸收、稳定性、代谢途径等） 药物浓度（ug、ng级） 样本类型（血、组织需除蛋白；唾液需除黏蛋白；尿液需将缀合物水解） 分析技术： 光谱分析（UV、荧光） 色谱分析（HPLC、GC、LC/MS、GC/MS、TLC） 免疫分析（放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫