异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分离提纯及酶性质的研究小论文.doc

异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶分离提纯及酶性质的研究 辛国华1,鱼红闪2,金凤燮3 （1.生物工程学院，11108220302322） 摘要: 本文主要对微生物Absidia sp.R9g所产的异槲皮苷-β-葡萄糖苷酶进行分离提纯及其酶性质研究。研究表明该酶能水解异槲皮苷的β-葡萄糖基，得到槲皮素。该酶蛋白的分子量约为50kDa,酶反应的最适温度为50℃，最适pH为5.0，在温度60℃以下，pH3.0-7.0范围内酶活力较稳定，酶反应动力学研究，得到最大反应速度Vmax=3.2619mmol/L·h，米氏常数Km=57.6352mmol/L。Purification and Characterization of Isoquercitrin - β – glucosidase （XIN Guo-hua1，YU Hong-shan2，JIN Feng-xie3） (School of Biological Engineering, 11108220302322) Abstract : This paper presents the separation and the study of characterization of the isoquercitrin - β – glucosidase from microorganisms Absidia sp.R9g. This enzyme can hydrolyze the β - glucosidase of isoquercitrin to produce the quercetin．The molecular weight of the enzyme is about 50 kDa．In the?enzymatic reaction, the optimum temperature was 50 ℃, the optimum pH was 5.0. This enzyme was stable at pH 3.0~7.0, below 60 ℃ . The Vmax and Km for isoquercitrin - β - glucosidase was 3.2619mmol/L·h and 57.6352mmol/L, respectively. Key Words：Isoquercitrin - β - glucosidase；Quercetin；Enzymatic propert 0 引言 1材料与方法 1.1 材 料 异槲皮苷槲皮素样品由美国sigma公司，菌种Absidia sp.R9g由大连工业大学生物工程学院菌种保藏所提供，薄层层析板(TLC)为德国Merck公司生产的硅胶板。1.2 实验方法 本实验采用的液体培养基配方为：％的槐花浸出液97.0％麦芽汁浓度为5的麦芽汁。121 ℃下湿热灭菌将Absidia sp.R9g接种于液体发酵培养基中，接种量为1~2环。然后将置于温振荡器中，30 ℃，160 r/min的条件下培养菌体4~5 d。 在条件下。再冷冻离心，弃去上清液，沉淀。沉淀用0.02M pH 5.0的HAC-NaAC缓冲液溶解，再次离心取上清液，即为酶液粗酶液4℃ 条件下保存备用。Sephadex G-100 分子筛分离，收集有酶活的分布收集管并将其合并；利用上述收集液进行第一次DEAE-Cellulose DE52柱，收集酶活相对集中峰值的分布收集管；再次进行二次DEAE-Cellulose DE52柱分离，得到纯度很高的目的蛋白。将提纯出来的蛋白样品经处理后,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离[10]。用肌球蛋白（200kDa）、β半乳水解酶（116kDa）、磷酸酶b（97.2kDa）、牛血清蛋白（66.4kDa）、卵清蛋白（44.3kDa）0.02M pH5.0醋酸缓冲液溶解异槲皮苷，制成2.0mg/ml标准品溶液作为提纯酶反应的底物。取0.05ml异槲皮苷标准品溶液，加入等体积的酶液，于50℃下反应12小时,然后加入0.1ml水饱和正丁醇终止酶反应，待分层后，利用上层溶液进行TLC薄层层析检测[12]。展开剂组成为乙酸乙酯:丁酮：甲醇:水=10 :7 :1:1。TLC图谱扫描后用Bandscan工具软件进行分析。在上述反应条件下，每小时水解消耗1mol异槲皮苷所需的酶量为一个活力单位。 2 结果与讨论 2.1 Sephadex G-100分子筛层析，通过酶反应TLC薄层层析检测酶活力，收集酶活力相对较高的分布收集管，进行合并。多次重复上述步骤，将多次层析合并的酶液进行DEAE-Cellulose DE-52 阴离子交换柱层析分离，通过蛋白紫外吸收值检测仪得到蛋白质吸收曲线，根据曲线检测吸收峰值管的酶活，将酶活较高的吸收峰附近的分布收集管收集