一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化.pdf

大 东 南 学学 SoutheastUniv JSoutheastUniv眷(Med医‘Sc学iEE版ddi)；2一0…10，’A…ug。’．一29、(4。)’．3…61_3…66 ·361· 一 种新型结缔组织生长因子人源单链抗体 的 可溶性表达 以及分离纯化 范小波 ，苟丽霞 ，刘昭 ，沈子龙 ，刘乃丰 ，吴国球 ，奚涛 (1．中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009；2．东南大学附属中大医院临床检验中心，江苏 南京 210009) [摘要]目的：研究单链抗体(scFv)在不同载体和菌株中的表达以及表达产物的免疫学活性评价。方法：将 人源化单链抗体的基因通过酶切、连接等生物技术的方法克隆到pET28a、pET32a和pET—EI：X3种不同的 载体中，并选用不同的表达菌株进行表达，观察单链抗体的表达情况并对抗体的可溶性表达进行优化，采用 亲和层析和分子筛层析对 目的蛋 白进行纯化，并在体外研究 目的蛋 白的生物学活性。结果：抗结缔组织生长 因子单链抗体在 pET28a／BL21(DE3)中不能表达 ，在 pET32a／BL21(DE3)和pET。EI：X／BLR(DE3)中均成功 表达，但是在pET。EI：X／BLR(DE3)中scFv抗体无法从内含肽(intein)上裂解。scFv在pET32a／BL21(DE3) 中表达量占总蛋白的30％左右，经过两步层析纯化后纯度达到85％以上。体外免疫试验显示，目的蛋 白具 有 良好的免疫学活性。结论：人源化抗结缔组织生长因子单链抗体 scFv在大肠杆菌中的表达需要分子伴 侣，通过低温表达策略在pET32a／BL21(DE3)中成功得到表达。 [关键词]人源单链抗体；结缔组织生长因子；弹性蛋 白；分离纯化 [中图分类号]Q512．6；Q511；Q591．2 [文献标识码]A [文章编号]1671-6264(2010)04—0361—06 doi：10．3969／j．issn．1671-6264．2010．04．002 Solubleexpressionandpurification ofanovelsingle。chainFvantibody againstconnectivetissuegrowthfactor(CTGF／CCN2) FAN Xiao。bo ，GOU Li。xia ，LlU Zhao。 SHEN Zi。long ，LlU Nai。feng ，WU Guo。qiu ， ， XITaO (1．SchoolofLifeScienceandBiotechnology，ChinaPhanmweuticalUniversity，Nanjing210009，China；2．CenterofClinalLabora— toryMedicine，ZhongdaHospital，勘 ^e椰￡University，Nanjing210009，hCina) [Abstract]Objective：Toinvestigatetheexpressionofanovalanti’CTGFsingle—chianFv(scFv)antibodywithin differentplasmidand／orhostcellandtheinvitroimmunoreactiVityofthisscFvantibody．M ethods：Inthisstudy， ascFvantibodyagainstCTGF／CCN2withfullhuman sequencewascloned intothreedifferentvectors，pET28a， pET32aandpET—El：X，andexpressedinBI21(DE3)，BI21(DE3)，BLR(DE3)，respectively．Inaddition， weoptimizedthetemperatureforsolubleexpressionofthescFv．Theexpressedtargetproteinwasthenpurifiedby usingmolecularfilterandaffinitychromatography，andthebioactivitywasalsoanalyzed．Results：ThescFvanti· [收稿 日期]2010—03—16 [修回日期]20100·4—13 [基金项 目]国家自然科学基金资助项 目(N