一种新的混合斑精子分离方法.pdf

V0l_36 高等 学校 化 学 学报 No．5 2015年 5月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 886～892 doi：10．7503／cjc 一 种新的混合斑精子分离方法 伍贤军 ，赵 兵 ，缪 璇 ，钱 程 ，王冰瑜 ，李晓萌 ，杨百全 (1．吉林省公安厅物证鉴定中心，长春 130051； 2．东北师范大学生命科学学院分子表观遗传学教育部重点实验室，长春 130024) 摘要 制备了精子表面膜抗原受精素卢蛋白(Fertilin卢)的特异性抗体 ，通过抗原．抗体反应和抗体固相偶联 技术，将抗体连接到琼脂糖球珠上 ，建立了混合斑精子分离纯化的新方法．首先，通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增编码人受精素卢蛋白第341～373位氨基酸的基因序列，构建 PGEX-4T．1／Fertilin口原核表达质 粒；其次，诱导表达GST—Fertilin 融合蛋 白，制备受精素 蛋白多克隆抗体，免疫荧光检测结果表明，受精 素卢蛋31定位于精子的头后部，并且阴道上皮细胞没有受精素卢蛋 白的表达；最后 ，将受精素 抗体与 ProteinA琼脂糖球珠连接构建固相抗体系统，将精子吸附于表面，可从混合斑 (精子与阴道上皮细胞混合液) 中分离纯化精子．本文为性犯罪案件侦破提供了新的方法． 关键词 混合斑；受精素 蛋白；多克隆抗体 中图分类号 0657 文献标志码 A 在性犯罪案件中，混合斑主要是指男性的精液与女性的阴道分泌液组成的斑痕，是法医物证检验 中常见的检材类型…．由于精子细胞膜和核膜蛋 白质中富含二硫键 ]，导致其检测存在纯化效果差、 耗时长及消耗人力的弊端，且精子损失达70％，影响了检测成功率 ]．因此，建立一种新型的混合斑 精子分离方法对于法医物证检验具有重要的意义． 受精素卢蛋白(Fertilin ，定位于人类8号染色体上)有选择性地表达在人类睾丸组织 (精子) 中 ，在精子发生、成熟、获能及精卵结合和融合过程中发挥重要作用．受精素 蛋 白具有前导肽区、 金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、富含半胱氨酸结构域、表皮生长因子 (EGF)样重复序列、跨膜 结构域和短的胞质尾部7个基本结构区_5]．通过对受精素JBl蛋 白的疏水性和抗原决定簇进行分析 ]， 选择金属蛋白酶结构域的第341—373位氨基酸残基作为靶抗原制备其特异性抗体． 琼脂糖球珠 ProteinA能特异性地与抗体的FC区结合，被广泛应用于生物学研究 ]． 基于抗原一抗体反应 和固相分离原理 ，本文针对精子表面抗原受精素 蛋白胞外域制备特异 性抗体，并结合抗体固相偶联技术，建立了新型的混合斑中精子的分离纯化方法． 1 实验部分 1．1 试剂与仪器 人精子由吉林省人类精子库提供；人阴道上皮细胞由吉林省公安厅物证鉴定中心提供；大肠杆菌 DH5ot(克隆宿主)、BL21(表达宿主)及pGEx_4T一1为本实验室保存的菌株和质粒；Tfizol试剂盒(美国 Invitrogen公司)；TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver．3．0试剂盒，14DNA连接酶及各种限制性 内切酶 (日本TaKaRa公司)；琼脂糖凝胶回收DNA试剂盒(德国Qiagen公司)；低分子量蛋白Marker(上海生 物工程有限公司)；异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG，华美生物工程公司)；HRP标记的羊抗兔IgG(美国 Proteintech公司)；谷胱甘肽Sepharose4B(英国GEHealthcare公司)；Tris．HC1缓冲液和弗氏佐剂 (北 收稿 日期：2014-10-30．网络出版 日期 ：2015-04-14． 基金项 目：国家公安部重点研究计划项 目(批准号：2011ZDYJJNWZ007)资助． 联系人简介 ：杨百全，男，博士，主任法医师，主要从事精子分离纯化及DNA检验和纳米复合磁性材料的应用研究 E—mail：bqyang1971@ 163．corn 李晓萌，女，博士，教授，主要从事肿瘤