三种FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定.pdf

浙江理_7-大学学报 ，第 27卷 ，第2期 ，2010年 3月 JournalofZhejiangSci—TechUniversity Vo1．27，No．2，Mar．2010 文章编号2O10)02—031305 三种 FLAG融合标签的构建、表达及亲和常数测定 戴志昂。丁先锋 (浙江理工大学生命科学学院，杭州 310018) 摘 要 ：FIAG融合标签是 由8个氨基酸组成 的短肽 ，可用于重组蛋 白的免疫吸附纯化。为 了建立一个基于 FIAG融合标签的共表达纯化体 系，将 2个新 的FIAG标签序列 DYKDYKDYK和 DYKDEDDK与 FLAG标签的 原有序列DYKDDDDK分别命名为FLAG1、FLAG2和 FIAG3，利用 PCR将 FLAG标签融合到SHP2酪氨酸磷酸 酶 NSH2结构域序列的C端 ，并将其重组到原核表达载体 pGEX-2T中，并在大肠杆菌 中进行表达。利用 GST亲和 层析柱和分子筛层析柱纯化融合蛋 白，Westernblotting法检测其免疫活性。免疫印迹结果表明，3个FLAG融合标 签都可以被抗一FIAG单克隆抗体M2(AFM2)特异性识别。利用EIISA技术测定 3个FLAG标签与 AFM2的亲 和常数 (1／Kd)，其 Kd值分别为0．1438、0．1281、0．0801ptmol／I。 关键词：FIAG融合标签；免疫吸附纯化；抗一FIAG单克隆抗体M2；亲和常数 中图分类号 ：Q78 文献标识码 ：A 0 引 言 F1AG融合标签是 由8个氨基酸 (DYKDDDDK)组成的短肽 ，可用于重组蛋 白的免疫吸附纯化 j。 FIAG标签结构短，可 以用人工合成的寡核苷酸来编码l1]，融合到蛋白的N端或 C端，融合表达不会对蛋 白 的生物活性产生影响，而且FLAG标签与融合蛋 白之间含有一个肠激酶切割位点，可以通过肠激酶切割除 去一。]。利用FLAG融合标签简单、快速的优点，可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统ll6。]。 根据不同的抗原结合要求，现有 3种单克隆抗体 M1、M2和 M5可供使用l8 ，单抗M1只能特异性的 识别位于N末端的FLAG融合蛋 白 ，单抗 M5的出现是为了应用于类似NMet—FLAG-C的序列 ，显示出 对N端Met—FIAG融合蛋 白具有更高的亲和力，而M2单抗可以结合到以上提到的所有类型的N末端或C 末端 FIAG融合蛋白上，具有通用性一1214；。 根据美 国休斯顿大学高晓莲实验室设计 的新 FLAG标签 ，构建 了 3个重组质粒 pGEXHis—NSH2一 FIAG1、pGEX—His—NSH2FIAG2和 pGEX—HisNSH2FIAG3。重组质粒在大肠杆菌中成功表达，融合蛋 白纯化后经鉴定具有免疫活性 。利用非竞争性 ELIsA测定 3个融合标签和 AFM2的亲和常数 (1／K口)，为 FIAG标签的进一步应用奠定基础。 1 材料和方法 1．1 材料 质粒模板pGEX-2TNSH2由美国休斯顿大学高晓莲实验室提供，菌种 TG1，BL21(DE3)由浙江理工大 学生命科学学院实验室保存 ，限制性 内切酶EcoRI和BamHI为NEB(NewEnglandBio!abs)产品，PCR 产物纯化试剂盒为 Axygen公司产品，GST亲和层析柱为 GenScript产 品，凝血酶为 Sigma产品，Sephadex 75HP填料为北京韦氏博慧色谱科技有限公司产品。 收稿 日期：2009--02 16 作者简介 ：戴志昂(1983 )，男，浙江台州人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。 314 浙 江 理 工 大 学 学 报 2010年 第 27卷 1．2 重组质粒 pGEX—His—NSH2～FIAG的构建 1．2．1 引物设计 根据NSH2的DNA序列和3个FIAG标签的序列，每个标签设计合成两对特异的上游引物和下游引 物，经过两次PCR，将 FLAG标签融合到NSH2的C端，同时在其N端加上His标签，为方便克隆，上游引 物的5’端引入 BamHI酶切位点，下游引物的5’端引入 EcoRI酶切位点。第一次PCR反应，上游引物为 5’一CCATCATCATCATCATCATATG