中国小麦花叶病毒（CWMV）单克隆抗体制备及其检测应用.pdf

蚕蠹 Onlinesystem：http：／w／ww．jabiotech．org ●生●麓●■■ 2 -¨L～ 一 gy 陆 暑_ §=： ～ 一 中国小麦花叶病毒(CWMV)单克隆抗体制备及其检测应用 刘欢 李娜 周雪平 任春梅 程兆榜 吴建祥 1浙江大学生物技术研究所 ／国家水稻生物学重点实验室，杭州310058；2江苏省农业科学院植物保护研究所，南京210014 +同等贡献作者 通讯作者，wujx@zju．edu．cn 摘 要 中国小麦花叶病是引起小麦(Triticumaestivum)严重减产的中国小麦花叶病毒(Chinesewheat mosaicvirus，CWMV)造成的。本研究旨在 以制备的抗CWMV特异性单克隆抗体(monoclonalantibody, MAb)为核心建立检测CWMV的血清学方法，为该病毒病的诊断和科学防控提供技术支撑。用CWMV 提纯病毒免疫小鼠(Musmusculus)，经细胞融合、培养基筛选培养、阳性细胞的检测与单克隆化后，共获得 4株能分泌抗CWMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 5H5、7C2、9A7和 12E5，并注射入BALB／c小鼠(Mus musculus)腹腔制备单抗腹水；间接酶联免疫吸附实验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)表明，4 种单抗腹水效价均达到l0～，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa链。Westernblot分析表明，4株单克隆抗体 均能与CWMV的外壳蛋 白亚基有特异性反应 。利用制备的单抗建立检测 田间小麦样 品中CWMV的抗 原包被酶联免疫吸附实验(antigencoatingplateenzyme—linkedimmunosorbentassay,ACPELISA)~]斑点 酶联免疫吸附实验(dot。enzyme—linkedimmunosorbentassay,dot．ELISA)，结果表 明，该两种血清学方法检 测感染CWMV小麦植物组织粗提液呈特异性阳性反应，而检测感染小麦黄花叶病毒 (Wheatyellow mosaicvirus，WYMV)的小麦、感染大麦黄花叶病毒(Barleyyellowmosaicvirus，BaYMV)的大麦(Hordeum vulgare)和健康小麦均呈阴性反应，说明建立的两种方法能特异性地检测小麦植物中的CWMV。灵敏度 分析表明，以5H5和 12E5单抗为核心建立的ACP—ELISA方法检测小麦病叶的灵敏度达到 1：81920(W／ g／mL)，而 以7C2和9A7单抗为核心建立的ACP—ELISA方法检Nd,麦病叶灵敏度达到1：40960(w g／mL)倍稀释 ；以12E5和5H5单抗为核心建立的dot．ELISA方法检测小麦病叶的灵敏度达到1：2560倍稀 释(w g／mL)，而以7C2和9A7单抗为核心建立的dot．ELISA方法的检测灵敏度达到 1：1280倍稀释(w／ g／mL)。田间样品检测结果表 明，建立 的ACPELISA、dot—ELISA方法能准确、可靠地用于小麦中 CWMV病毒的检测，且进一步证明该病毒病在江苏和山东流行。CWMV单克隆抗体的制备及其血清学 检测方法的建立为中国小麦CWMV的诊断、预测预报及科学防控提供了物质和技术支撑。 关键词 中国小麦花叶病毒(CWMV)，单克隆抗体(MAb)，抗原包被酶联免疫吸附试验(ACP—ELISA)，斑 点酶联免疫吸附试验(dot。ELISA) DevelopmentofM onoclonalAntibodiesAgainstChinesewheatmosaic virus(CWMV)andTheirApplication LIU Huan LINa ZHOU Xue—Ping REN Chun—Mei CHENG Zhao—Bang W U Jian—Xiang 1StateKeyLaboratoryofRiceBiology,InstituteofBiotechnology,Zh~ia