人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及生物学活性鉴定.pdf

中国脊柱脊髓杂志2015年第 25卷第 6期 ChineseJournalof ineand inalc0 ，2015，Vo1．25，No．6 533 人髓核间充质干细胞的分离提纯方式及 生物学活性鉴定 唐 勇，阳普 山，吴剑宏 ，贾治伟，伍耀宏，李 浩，阮狄克 ，王德利 (海军总医院骨科 100048北京市) 【摘要】目的：探索人髓核问充质干细胞 (nucleuspulposusmesenchymalstem cells，NPMSCs)的提纯方法并鉴 定其生物学活性 。方法 ：收集 3例腰椎 间盘突出症患者 的退变髓核组织(Pfirrmann分级均为Ⅳ级)，利用酶消化 法分离细胞。采用两种方法分离提纯 NPMSCs，一组细胞采用贴壁法培养(贴壁组)，另一组通过流式细胞分选 技术利用 NPMSCs表面阳性标志物 CD73、CD90、CD105获得 NPMSCs(流式组)。将两种方法获得 的NPMSCs 进行体外培养扩增 ，分别进行形态学观察，细胞计数试剂盒(CellCountingKit，CCK一8)检测增殖能力。贴壁组 NPMSCs采用流式细胞分选仪在进行分选之前检测免疫表型，流式组 NPMSCs在生长达 80％～90％融合时进行 免疫表型的检测。向成骨、成脂、成软骨诱导分化 ，诱导 28d后分别进行茜素红染色观察其成骨能力、油红 0染 色观察其成脂能力、甲苯胺蓝染色观察其成软骨能力，利用 ImagJ软件计算染色区域所 占的面积百分 比。比较 两组 NPMSCs在形态学、免疫表型及增殖和分化能力的差异。结果：形态学观察发现 ，两组 NPMSCs均呈漩涡状 生长，贴壁组NPMSCs可见散在的单个细胞生长；流式组NPMSCs长梭形形态更长，排列更加紧密，少见散在的 单个贴壁生长细胞。流式细胞分选后所得的NPMSCs占细胞总数的(89．67~2．52)％，可以进行体外培养扩增．细 胞为典型的长梭形特征，漩涡状生长，在接种后 12～15d达 80％ 90％融合，增殖能力在接种后 5-13d明显高于 贴壁组 NPMSCs(P0．05)。流式组 NPMSCs的CD73、CD90、CD105的表达率 明显高于贴壁组 NPMSCs(P0．05)， 并且低表达 CD34、CD45及HLA—DR。两种方法获得的NPMSCs均能完成三系诱导分化，流式组成骨、成脂、成 软骨染色区域百分比均明显高于贴壁组 (P0．05)。结论：利用流式细胞分选技术从人退变髓核组织中可获得较 高纯度 的NPMSCs。并能进行后续培养扩增 。与贴壁法获得的NPMSCs相 比．流式细胞分选 的NPMSCs具有更 强的增殖与分化能力。 【关键词】髓核间充质干细胞；流式细胞分选；分离提纯；生物学活性 doi：10．3969~．issn．1004—406X．2015．06．10 中图分类号：Q813．1 文献标识码：A 文章编号：1004—406X(2015)一06—0533—08 Purification and identification ofhuman nucleuspulposusmesenehyrealstem cells／TANG Yong，YANG Pushan，WU Jianhong，etal／／ChineseJournalofSpineandSpinalCord，2015，25(6)：533-540 A【bstract] Objectives：Toexploreamethodforpurifyinghumannucleuspulposusmesenchymalstem cells (NPMSCs)，andtoidentifyitsbiologicalactivity．Methods：Degenerativenucleuspulposustissue(PfirrmannⅣ) from 3 patientswith lumbardisc heriniation wascollected， cellswereisolated from human nucleuspulposus tissuebyusingenzymedigestion．Adherentmethoda