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第三章 灭菌技术 【本章学习的目的和要求】 1.了解培养基灭菌的原理；了解发酵培养液的无菌检查方法；了解空气除菌的原理。 2.熟悉空气过滤除菌的流程和常见设备无菌。 3.掌握常用的灭菌方法和原理；掌握培养基分批灭菌和连续灭菌的操作流程；掌握发酵用空气的质量标准。 第一节 灭菌 灭菌是指用物理的或化学的方法杀灭或除掉物料及设备中一切有生命的有机体的技术或工艺过程。 一、常用灭菌方法的基本原理 （一）化学物质（药剂）灭菌 化学药剂适用于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。 常用的化学药剂介绍如下： 1．乙醇 70%-75%乙醇溶液杀菌作用最强 2．甲醛 将甲醛溶液（37%）直接加热，按18ml/m3计算用量 3．新洁而灭 0.25%的溶液 4．石炭酸3%-5%的水溶液 (二)辐射灭菌 紫外线波长在240-300nm范围内 （三）干热灭菌 一般要求160-170℃，保温1-2h (四)湿热灭菌 一般的湿热灭菌条件为121℃，30min （五）过滤除菌 二、培养基的灭菌 目前在工业生产中培养基的灭菌通常采用湿热灭菌法，包括实罐灭菌（实消）、连续灭菌（连消）两种方法 （一）微生物的死亡速率与理论灭菌时间 1．微生物的热阻 致死温度:杀死微生物的极限温度。 致死时间:在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间成。 在致死温度以上，温度越高，致死时间越短。 热阻:是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。 表4-3 微生物对湿热的相对抵抗力 表4-4 在不同温度下的湿热灭菌杀死芽孢所需要的时间 2．微生物的热死规律——对数残留定律 微生物热死是指微生物受热失活直到死亡。微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固变性所致。 在培养基进行湿热灭菌时，微生物受热后，其死亡细胞的个数变化与化学法反应的浓度变化一样，遵循一定的规律，培养基中的微生物受热死亡的速率与任一瞬间残存的微生物数量成正比，这就是“对数残留定律”，用下式表示： dN/dt= - kN （4-1） 式中 N——培养基中残存活菌数 t ——受热时间，min k ——反应速率常数(又称比死亡速率常数)，min-1；与灭菌温度、菌种特性有关 Nt=N0e-kt 式中N0——灭菌开始时原有的菌数，个； Nt ——灭菌结束时残留的菌数，个。 根据上述的对数残留方程式，如果要求达到彻底灭菌，即Nt=0,则所需的灭菌时间t为无限长，这在实际生产中是不可行的，因此实际设计时，常采用Nt=0.001（即在1000批次灭菌中只有1批是失败的）。如以残留菌数的对数与灭菌时间t的实测数在半对数坐标纸上绘图，得出的残留曲线为一直线其斜率的绝对值为比死亡速率常数k。 4-5表121℃下，不同细菌芽孢的k值 （二）培养基的分批灭菌（实罐灭菌、实消） 1．培养基预热 灭菌时，培养基需要先加热到80-90℃，然后再导入蒸汽升温到120-130℃进行灭菌。预热的方法是：先将各排气阀门打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升到80-90℃，将排气阀门逐渐关小。 预热的目的：一是防止直接导入蒸汽时由于培养基与蒸汽的温差过大而产生大量的冷凝水使培养基稀释，二是防止直接导入蒸汽容易造成泡沫急剧上升而引起物料外溢。 2．培养基灭菌 当罐温升到80-90℃时，将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接导入罐内、使罐温上升到120-130℃，保温30min。 灭菌时应注意：各路蒸汽进口要畅通，防止逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度；排气量不宜过大，以节约蒸汽用量。 3．冷却 待灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后打开夹套或蛇管冷却水冷却，以避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。 注意：在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基（或物料）将倒流入过滤器内。 1．连续灭菌工艺的特点 （1）在较高的温度和较短的时间内灭菌，营养成分破坏的少； （2）发酵罐非生产占用时间缩短，容积利用率提高； （3）热能利用合理，适于实现自动化控制； （4）不适用于粘度大或固形物含量高的培养基灭菌； （5）增加了一套连续灭菌装置，操作环节增多，从而增加了染菌的机率。 2．连续灭菌操作步骤 （1）配料 （2）培养基预热 在预热桶内，一般可先将培养基预热到70-90℃。 （3）加热使料液温度在较短的时间（20-30s）内迅速达到灭菌温度，连续灭菌的温度一般以126-132℃为宜，加热采用的蒸汽压力一般为4.5-8×105Pa，加热器有塔式和喷射式两种。 （4）保温（维持） （5）降温 （40-45℃）