胡萝卜愈伤组织的诱导培养(实验报告).doc

本科学生综合性实验报告 学号 114120*** 姓名 @ ￥ 学院 生命科学学院 专业、班级 11应用生物教育%班 实验课程名称 植物组织培养实验 教师及职称 龙 维 彪（讲师） 开课学期 2013 至 2014 学年 下 学期 填报时间 2014 年 5 月 20 日 云南师范大学教务处编印 一．实验设计方案 实验序号 一 实验名称 胡萝卜愈伤组织的诱导培养 实验时间 2014.3.17——2014.5.12 实验室 睿智楼3幢325 实验内容： 1-1 MS培养基母液和常用试剂的配制 1-2 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制 1-3 胡萝卜愈伤组织的诱导 1-4 胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制 1-5 胡萝卜愈伤组织的继代培养 1．实验目的： 1)、通过本次实验，使学生能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识； 2）、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的流程及操作中应注意的事项，学会设计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方； 3）、通过本次实验，使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术； 4）、通过本次实验，使学生进一步熟悉配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基；掌握愈伤组织状态的调控手段，设计适合的使愈伤组织增殖快、结构疏松的增殖培养基，以便能培养出下次细胞培养的材料； 5）、通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。 2． 实验原理、实验流程或装置示意图 实验原理 1）、培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质[1]。配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。 2）、将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。 3）、将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块在无菌条件下接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织[2]。 4）、将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。 5）、将由胡萝卜肉质直根诱导产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织增殖培养基上培养，即可实现愈伤组织的增殖。 实验流程 1）、MS培养基母液和常用试剂的配制； 2）、配置胡萝卜愈伤组织诱导培养基； 3）、接种胡萝卜肉质根诱导愈伤组织产生； 4）、配置胡萝卜愈伤组织增殖培养基； 5）、接种胡萝卜愈伤组织进行增殖； 6）、实验结果观察记录。 3．实验设备及材料 1）实验用具和仪器 冰箱、普通天平、分析天平、各种型号的试剂瓶（棕色和白色）、三角瓶、果酱瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋/棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管，超净工作台、恒温培养箱、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅电热恒温干燥箱等。 2）药品和试剂： MS培养基母液（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）、常用试剂母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质（ 2,4-D、6-BA、KT）、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、95%酒精、75％酒精、0.1%HgCl2，、愈伤组织继代培养基、蒸馏水等。 3)材料： 胡萝卜肉质直根、处于脱分化进程中的胡萝卜愈伤组织 4．实验方法步骤及注意事项 实验步骤： （1）、MS培养基母液和常用试剂的配制流程 MS 培养基母液的配制 1）大量元素母液的配制： MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2 ? 2H20、MgSO4 ? 7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应[3]，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。配制的步骤为：确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合