课题申报书-用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能.doc

摘要： 项目研究内容和意义简介（限400字）： RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链RNA介导的序列特异性的mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。RNAi技术可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的筛选。本课题拟采用RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术，将我室新克隆的精子发生相关基因znf230的siRNA通过慢病毒（Lentivirus）系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发生过程，而在细胞水平上研究znf230基因表达受抑后对生精的影响，同时结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。 报告正文 （一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 1. 项目的立项依据（附主要的参考文献目录） 人类基因图谱解码已经完成。进入功能基因组学时代后，疾病相关基因以及重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。而随着新基因的分离与鉴定，对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。因此，建立或开发新的或实用的基因功能研究技术平台具有重要意义。 在功能基因组研究中，酵母杂交系统、DNA芯片、反义RNA、基因敲除(gene knock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功能研究的经典技术[1]，但由于外源及靶DNA发生同源重组的几率极低，重组体的筛选及检测即成为该技术的瓶颈，难以适应大规模的基因功能研究。近年来发展起来的RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方法，已成为生命科学领域研究的热点。其优点是可以简便地制备特定基因缺失表型的个体，较快捷地研究目的基因的功能，并使系统性、高通量功能基因筛选成为可能。 RNAi现象首先在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中被发现。它通过双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源靶mRNA的特异性降解，在转录后水平使基因沉默(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)[2,3]。RNAi技术现已成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中[4,5]，而在哺乳动物细胞内转染21-25 nt长度的siRNA也可以诱导特异性的基因沉默[6]，虽然这种效应具有瞬时性。目前，多个研究小组[7-10]已将靶向特异基因的shRNA表达质粒导入细胞，在聚合酶Ⅲ依赖性H1或U6启动子控制下获得siRNAs的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调，这为RNAi用于长期功能缺失型研究提供了新的思路。然而，目前在RNAi应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决，如： shRNA表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的RNAi效应，但多数仍呈瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的“knockdown”效应。 2）并非所有的组织或细胞的靶基因对RNAi敏感；某些基因的表型鉴定本身就存 在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。 3）目的基因序列上siRNA模板的选择无统一标准。实际操作中往往是试探性的，选 择不同序列RNAi效应差别大，抑制率可从0～90％不等。 因此，建立高效、稳定长期表达的RNAi传递系统正是该领域目前研究的关键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达[11]，但MMLV类病毒自身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。当前，新型第三代慢病毒(Lentivirus)系统正以其高效、稳定的特性在RNAi研究中倍受关注。Lentivirus来源于HIV-1病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细胞等，且转基因在生殖系统中可稳定传递[12,13]。Pfeifer[14]等的研究结果表明，Lentivirus介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem, ES)体内、外分化过程中表达，将Lentivirus感染的ES细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的新生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。Tiscornia[15]等将沉默GFP的Lentivirus感染GFP阳性转基因鼠卵细胞，发现新生鼠体内GFP荧光蛋白的表达明显降低。Rubison[16]等运用CD8/CD25 siRNA 的Lentivirus载体转染鼠ES细胞，生成了 “knockdown”转基因鼠，其效应维持长达30天之久并可传递下一代，充分显示了该方法