课题申报书-肝移植中移植排斥反应新机制的研究.doc

（一）立项依据与研究内容（4000-8000字） 1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）（基础研究需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；应用研究需结合国民经济和社会发展中迫切解决的关键科技问题来论述其应用前景。） 目前，移植排斥反应仍然是制约肝移植疗效的主要原因。虽然由于免疫抑制剂的临床应用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超过了80%。但是终生服用免疫抑制剂不仅成为患者沉重的经济负担，而且造成机体的免疫功能低下，可能促进肝炎及肿瘤复发，诱发感染、肿瘤等疾病。因此，找寻诱导特异性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。 特异性移植耐受是指在无需使用免疫抑制药物的情况下，受者的免疫系统对同种异体或异种供体抗原长期不发生免疫反应，而对其它抗原可发生正常免疫应答的状态。目前认为，诱导机体产生免疫耐受涉及免疫清除、免疫免疫抑制忽视graft versus host disease，GVHD)的发生率大大增加。(3)DC诱导的淋巴细胞失能状态可通过给予外源性IL-2而逆转；感染或其它因素引起机体强烈的免疫应答，产生大量的IL-2等细胞因子也可以通过旁效应解除失能的细胞克隆；失能状态的维持需要抗原的持续存在，抗原的去除也能逆转失能。(4)阻断协同刺激通路、应用针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体、合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别、阻断趋化因子及其受体等方法能诱导出确切的免疫抑制，但是其作用范围是全身性的、非特异性的，且一旦中止阻断剂的供给，则移植耐受消失。总之， 　 目前诱导移植耐受的方法存在非特异性、容易逆转、实际操作困难等缺陷。 肝移植排斥反应启动时，首先表现为淋巴细胞对汇管区中央静脉周围的浸润，随着排斥反应的进展，淋巴细胞的损伤导致小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞的炎症，最后波及汇管区周围的肝实质细胞，造成广泛的肝脏炎性反应。因此肝移植排斥反应的过程是从汇管区启动，进而扩展至小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞、汇管区周围的肝实质细胞。移植排斥反应发生时，CTL细胞在活化后可以通过以下两条途径杀伤靶细胞：(1)穿孔素/颗粒酶途径。(2)Fas/FasL途径：在CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性死亡。体外实验证实两条途径相互独立。然而体内实验证实单一阻断Fas/FasL途径即可抑制CTL对靶细胞的杀伤，其原因可能与体内环境有关28. 诱骗受体3(Decoy receptor 3，DcR3)是一种新发现的可结合FasL的可溶性TNFR超家庭成员，RNA印迹表明DcR3 mRNA 表达于胎肺、脑、肝及成人脾、结肠和肺，特别是在肺癌和结肠癌细胞系的表达很高，也可由T细胞丝裂原激活的外周血单核细胞分泌。DcR3 分子质量为35kDa，肽链长300个氨基酸残基。DcR3 的配体是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)与Fas竞争性结合FasL，阻断FasL所诱导的细胞凋亡，这一作用可以减弱CTL和NK细胞对靶细胞的杀伤[14]。(2)通过抑制LIGHT与HveA 或TR2之间的双向信号转导、TL1A至DcR3的单向信号转导来抑制T细胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基质细胞来源的因子1α(SDF-1α) 、FasL对T细胞的趋化作用，从而减少CD4+和CD8+T细胞对肿瘤的浸润。25. 27．(4)通过调节DC分化和成熟从而抑制CD4+ T细胞增生。20．(5)抑制T细胞伪足形成，阻止它们形成不可分离的细胞簇从而调节T细胞与其它细胞如APC的相互作用。7 因此根据其作用机理，人们推测其可能有以下四方面的作用(1)肿瘤细胞逃避免疫监视。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）诱导移植耐受。目前的研究工作已经肯定DcR3基因对肿瘤细胞逃避免疫监视、抑制炎症反应的作用，但DcR3基因的高表达与细胞癌变无相关性，不是癌基因。Wu等证实DcR3减少了FasL、IFN-γ诱导的胰岛细胞凋亡及胰岛素释放，可防止同种异基因胰岛移植时的胰岛原发性无功能。2Zhang等于心脏移植术前一天开始连续7天静脉注射DcR3，小鼠心脏存活时间比对照组延长3.3天，提示DcR3可以减弱T细胞对同种异体抗原的反应。24我们利用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作为DcR3基因的载体，将AAV病毒颗粒从门静脉、肝动脉、胆管注入冷保存时的供肝，成功实现了DcR3基因在供肝的表达，在没有使用免疫抑制剂的情况下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，继续观察中），而对照组仅存活了15天（见研究