黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体制备.doc

园 艺 学 报 2014，41（6）：1207–1217 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com 收稿日期：2013–11–26；修回日期：2014–04–28 基金项目：国家自然科学基金项目；国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2009CB19001）；国家现代农业产业技术 体系建设专项资金项目（CARS-25）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目 * 共同第一作者 ** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：jiangwj@） 黄瓜动蛋白特异肽段的原核表达和多克隆抗体 制备 王 燕*，杨学勇*，刘晓林，张晓孟，余宏军，蒋卫杰** （中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081） 摘 要：以黄瓜果实总RNA为模板，通过RT-PCR获得了动蛋白基因CsKF1和CsKF2的cDNA序 列，进行测序，构建T-easy载体。SMART在线预测CsKF1和CsKF2均含有动蛋白（Kinesin）约340个 氨基酸残基的马达区保守序列（moter domain）。体外表达蛋白的马达区和非马达区，将带有His标签的 CsKF1-N、CsKF2-C、CsKF1-M、CsKF2-M融合蛋白通过E. coli BL21（DE3）表达，摸索不同诱导条件 下目的蛋白的表达和纯化。其中His-CsKF1-N、His-CsKF2-C、His-CsKF1-M原核表达蛋白的分子量分别 为25、30和40 kD，均以0.1 mmol · L-1 IPTG，22 6 h诱导表达效果最好。His-CsKF2-M原核表达蛋 白的分子量约38 kD，以18 8 h诱导表达效果最好。融合蛋白His-CsKF1-N和His-CsKF2-C经过亲和 纯化后作为抗原，通过5轮免疫注射兔子后，取心脏血作为抗血清，通过AminoLink Plus kit试剂盒亲和 纯化得到多克隆抗体anti-CsKF1-N和anti-CsKF2-C。经过Western blot分析表明多克隆抗体具有特异性， 可与抗原特异结合。 关键词：黄瓜；果实；动蛋白；肽段；原核表达 中图分类号：S 642.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1207-11 Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of Kinesin Peptide Segment from Cucumber WANG Yan*，YANG Xue-yong*，LIU Xiao-lin，ZHANG Xiao-meng，YU Hong-jun，and JIANG Wei-jie** （Institute of Vegetable and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China） Abstract：Using the total RNA of cucumber（Cucumis sativus L.）fruits as the template，we cloned two novel Kinesin genes CsKF1 and CsKF2 by RT-PCR. The results from deduced protein sequence analysis indicated that both CsKF1 and CsKF2 contain moter domain of kinesin family. For protein expression in vitro，the coding regions for KF1-N，KF2-C，KF1-motor and KF2-motor were amplified by PCR and inserted into either the pET28a vector or the pET30a vector and then transformed into E. coli strain BL21（DE3）. SDSanalysis results showed that the recombinant plasmid