蓝色吸管尖端以手术刀切下约.ppt

Mass sample preparation MALDI-TOF Typical result from MALDI-Tof ESI tandem MS or LC/MS/MS Commercial available MALDI-TOF Microflex ?, Bruker MALDI micro?, Micromass Voyager DE-PRO?, ABI Principal for MALDI-TOF MASS Two kinds of TOF tubes Reflectron enhance the resolution Video for MALDI-Tof Video for MALDI-Tof (reflectron) Maximum allowable Contaminant concentration (approx.) 0.01% SDS 0.1% Detergents (not SDS) 0.01M Phosphate buffer 0.05M NH4HCO3 0.05M Tris buffer 0.5M Alkali metal salts 1% Glycerol 0.5M Dithiothreitol 0.5M Guanidine-HCl 0.5M Urea Peptide mass fingerprinting (PMF) tryptic digestion Gel Protein Database ? 1 2 3 compare: ?? is identical to ?? mass spectrometry stored data or theoretical? peptides * * Proteomics Session 10 Mass spectrometry for proteomics General procedures for mass sample preparation Washing staining material from the gel Equilibrium of gel to protease buffer condition Reduction and alkylation of proteins Digestion of proteins to peptides Extraction of peptides Purification of peptides (Optional) Prepare sample step by step A. Spot picking 將 1mL 藍色吸管尖端以手術刀切下約 0.5 mm。 利用此吸管尖將 CBR 染色上有興趣的點取下，裝入1.5 mL 離心管。 放入-20℃冰箱保存。 Prepare sample step by step B. Washing and equilibration 用1 mL ddH2O 洗膠體，每次10分鐘，洗兩次。 加入1 mL 50mM NH4HCO3 / 50% acetonitrile（v/v）震盪15 分鐘，再去掉液體。 加入0.2 mL acetonitrile（gel會縮小變白），待其變白去掉 acetonitrile。 加入0.5 mL 50mM NH4HCO3 ，震盪 5分鐘，再加入相同體積的acetontrile，震盪 15分鐘。 去掉全部液體。 加入0.2 mL acetonitrile，待膠體變白變小，去掉所有液體。 打開離心管蓋，待膠體變乾（可以在離心管中彈跳）。 Prepare sample step by step C. Reduction and alkylation 加入50μL 10mM DTT / 25mM NH4HCO3 （新鮮配置）於56℃ 反應 45分鐘，去掉全部液體。 加入50μL 55mM iodoacetamide（新鮮配置）於室溫避光30分鐘，去掉全部液體。 加入0.2 mL 50mM NH4HCO3 /50% acetonitrile（v/v），震盪 15分鐘兩次，去掉全部液體。 加入0.2 mL acetonitrile，待gel變白變小，移去所有的液體（越乾越好）。 打開離心管蓋，待膠體變乾（可以在離心管中彈跳）。 Prepare sample step by step D. Digestion 加入1μL trypsin 37℃ 反應 30分鐘。 再加入3μL 25mM NH4HCO3 37℃ 隔夜反應。 Prepare sample step by step E. Extraction 超音波 (s