转基因产品检测培训教材.ppt

表面等离子共振式传感器(Optical biosensors) 原理：当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面时，可引起金属自由电子的共振，使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为SPR角。SPR随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中SPR角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号。 将目标DNA和固定在传感器表面的探针杂交，使得溶液表面的折射率改变，该折射率的改变和杂交的目标DNA的质量成正比。 传感器检测技术 优点：灵敏度高 无需标记 实时监测 SupNIR-4000 近红外光谱法就是一种可以同时对农产品中所有有效成分进行一次性系统分析的研究方法。 近红外光谱主要是由于分子振动的非谐振性使分子振动从基态向高能级跃迁时产生的，记录的主要是含氢基团Ｘ－Ｈ（Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ）振动的倍频和合频吸收，适合用于碳氢有机物质的组成与性质测量。其工作原理是，样品的组成相同，其光谱也相同，反之亦然。如果建立了光谱与待测参数之间的对应关系（称为分析模型），则只要测得样品的光谱，通过光谱和上述对应关系，就能很快得到所需要的质量参数数据。 近红外光谱法（NIR） 转基因检测技发展趋势 定量检测技术为转基因产品的主要检测技术 转化事件特异性检测为转基因产品检测趋势 简单、快速、现场、高通量检测方法 多种检测技术的联合使用 GMO Detection Method Database (GMDD) －－ Nucleic Acid-based Methods List Protein-based Methods List 核酸DNA提取 主要包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。 基本原则 分离纯化核酸总的原则 ——保证核酸一级结构的完整性； ——排除其它分子对于提取和纯化的DNA的污染。 核酸的纯化三点要求 核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 核酸制备的步骤 多聚糖、酚复合物、蛋白质和其它细胞溶解物 破碎细胞或包膜－核酸游离在裂解体系中 沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。 裂解 抽提 沉淀 机械破坏 (如：碾磨、超声波处理、低渗裂解) 化学处理法(如：去污剂裂解、离液剂处理、硫醇还原等） 酶消化 （溶菌酶、纤维素酶等） 裂解 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。 通常使用苯酚和氯仿的混合物常用来除去多聚糖、酚复合物、蛋白质和其它细胞溶解物。酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。最后用氯仿抽提是为了去除核酸溶液中的痕量酚。 抽提 沉淀 常用醇来沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质。核酸是多聚阴离子的水溶液化合物，常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇等。 乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作 异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 异丙醇沉淀的核酸比较紧凑，易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。 Company Logo DNA提取方法 DNA提取的方法 B E C D A CTAB法 SDS法 聚乙烯吡咯烷酮法 其它 亲和诱捕核酸纯化方法 核酸质量评估与定量 荧光定量测定法 紫外分光光吸收法 琼脂糖凝胶电泳检测法 SGS GMO检测报告解读 35S启动子：位于外源目标基因的起点控制区 NOS终止子：位于外源目标基因的终点控制区 这两种筛选测试已经能够覆盖市场上大部分的转基因植物，测试中的任何一个阳性结果可能反映基因改造成分的存在。在以上两种测试中发现呈阳性结果的样品，需要通过以下两个测试，验证是否存在其它的外源目标基因。 Roundup Ready：抗除草剂草甘膦的基因（一种极普通的外源目标基因） Bt