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当归对小鼠骨髓胞增殖的影响及相关细胞信号通路的研究.pdf
摘要
本论文研究中药,主要是当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响,及对MAPK.JAK—sTAT
两条细胞信号通路的作用。
论文分为三部分内容。
第一部分是药物的选择和作用条件的优化。根据中药的药性,选择了4种有代表性的药
物,即补血药当归,理气药黄芪,滋阴药枸杞和祛风湿药雷公藤。采用这4种药物的制剂,
观察对小鼠骨髓细胞增殖的影响。
粒单核祖细胞集落形成及髓过氧化物酶活性测定结果表明,当归和黄芪提取物具有促进
粒单核细胞系列增殖的能力。分别检测了0.1mg/ml,ImghnI,10mg]ml3个不同剂量,作用有量
效关系。当归提取物的作用在lOmg/ml剂量较强,能增加CFU—GM形成数73%,MPO比
比酶活增加96%。
形成数和MPO比酶活的影响。
雷公藤制剂一一雷公藤多苷的作用是抑制性的,以O01rng/ml,0.Img/ml,1mg/ml三个不
同浓度进行研究,1m∥m1剂量作用较强,使CFU—GM形成数下降41%,MPO比酶活下降
77%。
根据上述结果,从中选择具有良好促骨髓细胞增殖能力的当归进行作用条件优化,继而
进一步深入研究。
以密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出单个核细胞,采用噻唑蓝比色法测定其生长增殖
能力。分别对细胞培养第1—7天每日测定,作出细胞生长曲线。结果表明,第3天是明显
的快速增殖期,适合于进一步研究。
在新鲜分离的单个核细胞中加入不同浓度的当归注射液,比较细胞生长增殖速度的变
化。结果发现,lmg/rnl浓度具有较强的作用效果。
常规细胞培养液中的胎牛血清含有多种促进细胞生长的活性因子,可能掩盖药物作用,
因此,在短期培养中目前有许多研究采用无血清培养。我们采用10%胎牛血清,5蚓眙牛血
清,无血清3种不同条件的培养液,观察当归的作用。
实验结果表明,无血清条件下当归注射液呈现出明显的促进细胞增殖能力,在作用较强
的1mg/ml剂量,能增加单个核细胞增殖444%。而在含10%胎牛血清及5%胎牛血清的培
养液,当归的促增殖作用在很大程度上被细胞的背景增殖所掩盖。因此,在后面细胞信号通
路的研究中,我们采用无血清或根据方法要求采用背景很低的O.5%血清。
论文的第二部分是当归制剂对单个核细胞增殖中MAPK信号通路的影响。
MAPK细胞信号通路是调节细胞生长增殖的一条重要途径,在细胞内信号传递中起枢
不同的亚型引起不同的细胞变化。ERKI/2,SAPK/JNK,P38是三种主要的亚型。
MAPK蛋白通过关键位点氨基酸的磷酸化而活化,这种变化可用特异性抗体加以检测。
在本文中,采用流式细胞术方法研究MAPK蛋白的活化。
对当归刺激后单个核细胞的MAPK分析表明,ERKl/2和P38MAPK蛋白被磷酸化活化,
作用自当归刺激30min后开始。而SAPIGJNK蛋白无明显变化。
进一步需要研究MAPK蛋白的这种变化对于细胞增殖有什么意义。我们选择以MAPK
特异性抑制剂阻断通路,观察细胞增殖的相应变化。
以ERKI/2抑制剂PD98059与单个核细胞共孵育,当归促增殖作用下降了57.3%;P38
明显影响。
上述结果证明,在当归引起的小鼠骨髓单个核细胞增殖中,ERKl/2和P38MAPK起到
了介导作用。
本论文的第三部分是研究当归制剂对另一条细胞信号通路——JAK.STAT信号通路的
影响。
JAK—STAT信号通路是调节细胞增殖的重要途径,细胞外的化学信号经过膜上受体,激
活JAK,继而活化STAT。胞浆中的STAT激活后移行入核,与DNA相应片断结合,引起
相关基因的活化。与MAPK信号通路相仿,STAT元件也有多种形式,包括STATl{,它们常
和STAT5作为研究对象。实验结果表明,当归刺激后,单个核细胞的STAT3和STAT5被磷
酸化活化,而STATl活性不变。
激活持续约60min.STAT5有微弱的基础激活,当归加入30min后,开始出现磷酸化活化的
明显增加。
总之,本论文的研究发现,中药当归,黄芪制剂对于小鼠骨髓细胞的增殖具有促进作用,
而以当归的作用较为明显。并且,当归的促增殖作用与MAPK和JAK-STAT两条信号通路
的活化有关。
关键词:
当归 骨萌细胞 单个核细胞 粒单核祖细胞集落 髓过氧化物酶
信号转导子和转录激活子 有丝分裂原激活的蛋白激酶 信号转导子和转录激活子
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