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谷氨酸摇瓶发酵实验 班级：生物工程091 学号：座机电话号码6027 姓名：滕韬 同组人员：滕树德、朱鹏、梁庭锋、梁启文 指导教师：黄瑶 谷氨酸发酵 摘要：谷氨酸的生物合成受机体内复杂机制的调控。影响谷氨酸发酵过程的参数有很多，谷氨酸发酵过程主要受种子质量，培养基组成，温度，pH以及供氧速率等因素控制。谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。L－谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界普遍存在的。多种食品以及人体内都含有谷氨酸盐，它即是蛋白质或肽的结构氨基酸之一，又是游离氨基酸，L型氨基酸美味较浓。 代谢途径： 谷氨酸产生菌中谷氨酸的生物合成途径如图所示：其中的代谢途径包括糖酵解途径 EMP 、磷酸己糖途径 HMP 、三羧酸循环 TCA循环 、乙醛酸循环、伍德-沃克曼反应 CO2固定反应 等。葡萄糖经过EMP 主要 和HMP途径生成丙酮酸，其中一部分氧化脱羧生成乙酰CoA进入TCA循环，另一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下，所合成柠檬酸，再经过氧化还原共扼的氨基化反应生成谷氨酸。 发酵过程控制要点： 发酵初期，菌体生长迟滞，约2～4h后即进入对数生长期，代谢旺盛，糖耗快，这时必须流加尿素以供给氮源并调节培养液的pH 值7.5～8.0，同时保持温度为30～32℃。本阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，菌体内生物素含量由丰富转为贫乏，时间约12h。 随后转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α- 酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段应及时流加尿素以提供氨及维持谷氨酸合成最适pH 7.2～7.4，需大量通气，并将温度提高到谷氨酸合成最适温度34～37℃。 发酵后期，菌体衰老，糖耗慢，残糖低，需减少流加尿素量。当营养物质耗尽，谷氨酸浓度不再增加时，及时放罐，发酵周期约为30 h。 材料： 1、仪器用具：洗瓶、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、pH试纸、天平、高压蒸汽灭菌锅、培养箱、高速离心机、分光光度计、移液器及枪头等 2、试剂：牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、蔗糖、琼脂、NaCl、NaOH、HCl、KNO3、葡萄糖、玉米浆、K2HPO4、MgSO4、KH2PO4、尿素、氢氧化钠、盐酸等。 3、菌种：黄色短杆菌 TG866 培养基配方 1 、活化斜面培养基 葡萄糖10g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5g/L ，NaCl12.5g/L，琼脂20 g/L，pH7.0-7.2，分装大试管约10ml/支，灭菌：115℃，25min，斜面高度占试管高度的2/3。 2、发酵培养基1号 玉米浆0.54ml，MgSO40.144g，K2HPO430.63g，KH2PO40.18g。加水到180ml，分装27ml/500ml三角瓶，然后每瓶加葡萄糖2.7g，灭菌：115℃，25min。 发酵培养基2号 蛋白胨3g/L，MgSO40.144g，K2HPO430.63g，KH2PO40.18g。加水到180ml分装27ml/500ml三角瓶，然后每瓶加葡萄糖3g，灭菌：115℃，25min。 相关试剂的配制 0.9%生理盐水：称取0.9GNaCl溶解于蒸馏水并定容至100ml。 50%葡萄糖配法：称取50g葡萄糖溶解于蒸馏水并定容至100ml。 20%尿素：称取22g尿素溶解于蒸馏水并定容至100ml，108℃，灭菌5min。 3mol/LHCl：取12mol/L浓HCl令HCl：H2O为1:3（体积比）配制。 2mol/LNaOH：称取8gNaOH固体溶解于蒸馏水并定容至100ml。 试验方法： 1培养基的配制及灭菌 按照培养基的比例分别称取所需物质的量，再进行溶解，包扎好之后进行高温灭菌，尿素分开灭菌，在108℃下，灭菌5min。灭完菌之后的培养基倒5支斜面培养基。 2接种 向倒好的斜面培养基接种，32℃下培养一段时间，然后放进冰箱保存待用。 3摇瓶补料发酵 向已灭菌的发酵培养基2号加入1.2ml20%尿素，用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至pH7.2-7.5。按1ml生理盐水/1支大试管斜面的用量，将活化斜面上已生长至对数期的菌种洗下，混匀。按3%的接种量接入种子培养基2号，9层纱布封口。240rpm，32℃摇瓶中培养7-8h使菌体长至对数生长后期。 向已灭菌的发酵培养基1号加入1.2ml20%尿素，用2mol/LNaOH或2mol/LHCl调至pH7.2-7.5。取3ml长对数生长后期发酵培养基2号接入发酵培养基1号，9层纱布封口。240rpm，32℃摇瓶中培养. 4 菌体生长情况 定时吸取0.5ml发酵液于1.5ml离心管中，8000r/min离心3min，吸取0.1ml上清液于比色管后，弃去离心管剩余的上清夜，沉淀稀释100倍，经过混匀后，用