重组大肠杆菌共表达 D-海因酶和 N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶.pdfVIP

第 6 卷 第 6 期 过 程 工 程 学 报 Vol.6 No.6 2006 年 12 月 The Chinese Journal of Process Engineering Dec. 2006 重组大肠杆菌共表达 D-海因酶和 N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶 胡晓佳， 李 强， 丛进阳 清华大学化工系生物化工研究所，北京 100084 摘 要：通过 PCR 分别扩增得到 N-carbamoylase 基因和上游带有 RBS 区的 D-hydantoinase 基因，并将其依次克隆入 pBAD/His A 质粒中，得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒 pBAD-CRH ，转化E. coli Top10F′得到重组菌 TaraCRH. 实 验证明，E. coli TaraCRH 对外源蛋白的表达控制严紧，而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因. 诱导条件优化 结果表明，诱导温度采用 29 ℃，培养基中阿拉伯糖浓度 0.05 g/L 可达到最高酶活. 进一步尝试采用玉米浆培养基代替 LB 培养基，在经过优化的玉米浆培养基中培养 TaraCRH 菌株，经阿拉伯糖诱导，海因酶和水解酶酶活分别达到 3.52 和 4.21 U/mL. 关键词：D-海因酶；N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶；多顺反子；大肠杆菌；共表达 中图分类号：Q7; Q8; TQ464 文献标识码：A 文章编号：1009?606X 2006 06?0948?06 1 前 言 为克服野生菌株的这些缺陷，人们通常将两种酶基 因克隆至适于基因工程操作的原核菌中进行表达. 作为 D-氨基酸是一种重要的化工和医药中间体原料，广 遗传背景最为清楚的原核生物，大肠杆菌是表达海因酶 [1?3] 泛应用于抗生素、杀虫剂、食品添加剂等生产领域 ， 和水解酶的优先选择. 各国的研究者采用不同的方法对 其中 D-对羟基苯甘氨酸 D-HPG 和 D-苯甘氨酸 D-PG 共表达海因酶和水解酶进行了尝试，如在同一质粒上构 是半合成类抗生素工业中非常重要的侧链原料，用于合 建两套表达原件[12,13] ，或采用两种不同的质粒共转化同 成多种头孢类或青霉素类抗生素. 目前，D-氨基酸的生 一宿主菌[14,15] ，或构建融合蛋白[16] ，但是这些方法均存 产方法有传统的化学法和新兴的酶法，而酶法由于其反 在一些问题，如两套表达原件的相互干扰，质粒共存方 应条件温和、污染少、转化率高等特点，越来越成为研 案中即使采用相容质粒也需要两种以上的选择压力才 [4?7] [8] 究的热点 . 酶法工艺主要采用两步酶催化 ，分别需 能维持质粒稳定性，而融合蛋白两结构域相互干扰严 要D-海因酶 D-hydantoinase 和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰 重，且其分子量较大，可溶性表达比较困难. 胺水解酶 N-carbamoylase 完成相应的催化过程. 首先， 原核生物天然表达原件通常为多顺反子结构，多顺 D-海因类衍生物在 D-海因酶作用下开环生成 N-氨甲酰 反子 Polycistron 是指一个启动子转录产生带有多个基 基-D-氨基酸，然后在 N-氨甲酰基-D 氨基酸酰胺水解酶 因阅读框的 mRNA 链，其上依次带有多个核糖体结合 作用下脱去 N-氨甲酰基，生成 D-氨基酸，并同时生成 位点 RBS 和编码基因. 多顺反子结构是自然选择的结 CO 和 NH . 如果以外消旋体 DL-海因类衍生物作为反 2 3 果，因此有足够的理由相信，在原核菌中进行双酶乃至 应底物，随着 D 型的消耗，L 型将自发向 D 型转变， 多酶的共表达，构建多顺反子结构的表达元件是简洁、 以维持两者平衡，直至最终消耗完全. 稳定、可靠的方案. 同时含有海因酶和水解酶的微生物可使两步酶法 本工作基于阿拉伯糖表达元件构建了多顺反子结 工艺在工业生产上简化至一步完成，这将带来良好的经 构的双酶表达系统，实现了 D-海因酶和 N-氨甲酰基-D- 济效益. 现已发现一些野生菌株能够同时表达海因酶和 氨基酸酰胺水解酶在同一宿主菌中的共表达. 水解酶，包括土壤杆菌[9]、假单胞菌[10]和其他原核菌[11] 等，本研究的A . radiobacter TH572 菌株就是从土壤中 2 材料与方法 分离得到的一株能够同时表达海因酶和水解酶的土壤 2.1 菌种与质粒 杆菌. 但与国内外其他研究者得到的野生菌株一样，用 野生菌A . radiobacter TH572 为本室保存，E . coli 野生菌A . radiobacter TH572 两步酶法生产 D-对羟基苯 Top10F′用作克隆菌株、质粒保存菌株