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金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化
巾回摩孝通报 第24卷 第 11期 2008年 11月 http：／／www．casb．org．cn ·73 · 金银花 ISSR—PCR反应体系的建立与优化 王晓明 ，李俊彬 ，李永欣 2，3，曾慧杰2,3 中南林业科技大学，湖南长沙410004；湖南省林业科学研究院，湖南长沙410004： ，林木无性系育种湖南省重点实验室，湖南长沙410004 摘 要：以金银花叶片基因组DNA为模板，通过单因素试验，研究了退火温度、TaqDNA聚合酶的用量 及模板DNA、引物、dNTPs、M： 浓度等 6种因素对ISSR—PCR扩增的影响，建立了适合于金银花IS— SR-PCR反应体系和扩增程序 ，即在 20 l反应体 系中，内含 lxPCR反应缓冲液 Mg free 、1．5UTaq DNA聚合酶、0．15mmol／LdNTPs、0．41xmol／L引物、1．5mmol／LMgC12、60ng模板 DNA。确定 了适 宜的退 火温度为49．9℃。扩增程序为94℃预变性 5min；35个循环为 94℃变性 30s，49．9℃退火30s，72℃延伸 1．5min：最后 72℃延伸 7min，4℃保存。利用优化反应体系，从 100条 ISSR引物 中筛选出 10条稳定性和 重复性高的引物 ；以这 1O条引物对22个金银花品种基因组 DNA扩增 ，共扩增 出 108条带，其 中多态性 条带96条，多态性条带比率为88．9％。金银花 ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花 品种鉴别、分类、种质资源遗传 多样性分析奠定了良好基础 。 关键词 ：金银花 ；ISSR；反应体 系；优化 中图分类号 ：$727．34 文献标识码 ：A EstablishmentandOptimizationofISSR．PCR ReactionSystem forHoneysuckle WangXiaoming ，LiJunbin，LiYongxin ，ZengHuijie五 1CentrolSouthUnivershryofFoestryTechnology．Changsha410004；qtunonAcademyofForestry,Changsha410004； 3HunanKeyLaboratoryofTreesClonesBreedingTechnoloyg，Changsha410004 Abstract：Basedon thegenomicDNA extractedfrom honeysuckle，thefactorsinfluencedISSR wereopti— mizedandtheeffectof6factorssuchasannealingtemperature，TaqDNA polymerasedosage，DNA templates concentration，primerconcentration．dNTPsconcentrationandMS concentrationonISSR amplificationwere tested usingsinglefactorexperiment．A reaction system andamplifiedproceduresuitableforhoneysuckle wereestbalished．thatis201xlamplificationreactionssystem containinglxPCRbuffer MgUfree ，1．5U Taq DNA polymerase，0．15mmol／LdNTPs，0．4wmol／Lprimer，1．5mmol／LMgC12’60ngtemplateDNA．rnleopti— mizedannealingtemperatureis49．9cI ．Theoptimalamplifiedprocedurewasasfollows：afterapre—denatur— ingof5minat94oC，35cycleswereperformedwith30Sofrdenaturingat94oC，annealingof30Sat49．9~C， extensionof1．5minat72oC。7minutesofextensionat72oC inthefinalcycleandholdat4~C．Usingthese optimal amplificationconditions，10stableandrepeatbaleISSRprimerswereselectedfrom total 100primers． ThegenomeDNA of22honeysucklecuhivarswereamplifiedwith 10ISSR pr
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