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金银花ISSR-PCR反应体系的建立与优化
巾回摩孝通报 第24卷 第 11期 2008年 11月 http://www.casb.org.cn ·73 · 金银花 ISSR—PCR反应体系的建立与优化 王晓明 ,李俊彬 ,李永欣 2,3,曾慧杰2,3 中南林业科技大学,湖南长沙410004;湖南省林业科学研究院,湖南长沙410004: ,林木无性系育种湖南省重点实验室,湖南长沙410004 摘 要:以金银花叶片基因组DNA为模板,通过单因素试验,研究了退火温度、TaqDNA聚合酶的用量 及模板DNA、引物、dNTPs、M: 浓度等 6种因素对ISSR—PCR扩增的影响,建立了适合于金银花IS— SR-PCR反应体系和扩增程序 ,即在 20 l反应体 系中,内含 lxPCR反应缓冲液 Mg free 、1.5UTaq DNA聚合酶、0.15mmol/LdNTPs、0.41xmol/L引物、1.5mmol/LMgC12、60ng模板 DNA。确定 了适 宜的退 火温度为49.9℃。扩增程序为94℃预变性 5min;35个循环为 94℃变性 30s,49.9℃退火30s,72℃延伸 1.5min:最后 72℃延伸 7min,4℃保存。利用优化反应体系,从 100条 ISSR引物 中筛选出 10条稳定性和 重复性高的引物 ;以这 1O条引物对22个金银花品种基因组 DNA扩增 ,共扩增 出 108条带,其 中多态性 条带96条,多态性条带比率为88.9%。金银花 ISSR反应体系的建立为利用ISSR标记技术进行金银花 品种鉴别、分类、种质资源遗传 多样性分析奠定了良好基础 。 关键词 :金银花 ;ISSR;反应体 系;优化 中图分类号 :$727.34 文献标识码 :A EstablishmentandOptimizationofISSR.PCR ReactionSystem forHoneysuckle WangXiaoming ,LiJunbin,LiYongxin ,ZengHuijie五 1CentrolSouthUnivershryofFoestryTechnology.Changsha410004;qtunonAcademyofForestry,Changsha410004; 3HunanKeyLaboratoryofTreesClonesBreedingTechnoloyg,Changsha410004 Abstract:Basedon thegenomicDNA extractedfrom honeysuckle,thefactorsinfluencedISSR wereopti— mizedandtheeffectof6factorssuchasannealingtemperature,TaqDNA polymerasedosage,DNA templates concentration,primerconcentration.dNTPsconcentrationandMS concentrationonISSR amplificationwere tested usingsinglefactorexperiment.A reaction system andamplifiedproceduresuitableforhoneysuckle wereestbalished.thatis201xlamplificationreactionssystem containinglxPCRbuffer MgUfree ,1.5U Taq DNA polymerase,0.15mmol/LdNTPs,0.4wmol/Lprimer,1.5mmol/LMgC12’60ngtemplateDNA.rnleopti— mizedannealingtemperatureis49.9cI .Theoptimalamplifiedprocedurewasasfollows:afterapre—denatur— ingof5minat94oC,35cycleswereperformedwith30Sofrdenaturingat94oC,annealingof30Sat49.9~C, extensionof1.5minat72oC。7minutesofextensionat72oC inthefinalcycleandholdat4~C.Usingthese optimal amplificationconditions,10stableandrepeatbaleISSRprimerswereselectedfrom total 100primers. ThegenomeDNA of22honeysucklecuhivarswereamplifiedwith 10ISSR pr
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