阿维链霉菌中aveD基因缺失对阿维菌素合成的影响.pdfVIP

卷 期 ! # 微 生 物 学 报 ’ ! 0’ # 年 月 $$ %$ !#$ %’ * +$ ,-$ *+,’-./ $$ !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 阿维链霉菌中$./0 基因缺失对阿维菌素合成的影响 陈 芝 文 莹 宋 渊 李季伦 （中国农业大学生物学院微生物学系 北京 %$$$1! ） 摘 要：利用 基因的缺失载体 （ ）对阿维菌素（ ）产生菌 !#$ 94:8 9;4%%51 #$ !#$ ./ .+,?@ 阿维链霉菌（ ） 的 基因进行缺失获得 缺失突变株。经摇瓶 %’# *+,#- !#’*../.- 6231 !#$ !#$ 发酵和 检测，发现该突变株只产生阿维菌素 组分。说明将阿维链霉菌的 基因 ABC4 D !#$ 缺失，并不影响下游 !#0 的表达。缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量基 本相同，突变株中 的产量略有提高，阿维菌素 的含量显著提高。 D% D 关键词：阿维链霉菌，!#$ 基因缺失，阿维菌素D 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： （ ） E151 F %5 $$$%32$1 $$ $#3$#5!3$# 阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一类结构相似的十六元环大环内酯齐墩果糖双糖衍 生物，共有八个组分，分别命名为 ， ， ， ， ， ， 和 ，其中 组分含 %G %- G - D%G D%- DG D- G ［］ 量占 以上，组分含量少于 % 。阿维菌素 的杀虫活性最强，但毒性较大；阿维 8$ H - $ H D% 菌素 的 位加氢还原产物称为伊维菌素（ ），具有相同的杀虫活性，但毒 D% 435 I ./ .+,?@ ［］ 性低 。由于阿维菌素和伊维菌素具有高效、低毒、广谱的杀虫特性，自 年代上市以来 8$ 被广泛用于农业和畜牧业，产生了巨大的经济效益。 大约 的阿维菌素在 为 基团，即阿维菌素 组分；其余的在 为氧甲基， #$ H 4# *A D 4# 即为阿维菌素 组分。阿维菌素 组分向 组分的转化是由 基因编码的阿维菌素 D !#$ ［］ 5 甲基转移酶催化的，由 腺苷甲硫氨酸提供甲基 。由于阿维菌素 组分的杀虫 D #3 13 J3 D 活性高于 组分，阿维菌素 组分又是伊维菌素的原料药，因此阿维菌素 组分在工业 D% D 上有更大的应用价值。我们曾企图通过 的插入失活来获得仅产阿维菌素 组分的 !#$ D 突变株，但 !#$ 与!#0 属于同一个顺反子，由于极性效应，插入失活也造成了下游的 ［］ ! 基因也不能表达，形成的是产生 氧 阿维菌素 的突变株 。为避免极性效应， !#0 4#3 3 D 我们对 进行了基因缺失，结果获得了仅产阿维菌素 的突变株。 !#$ D ! 材料和方法 ! ! 材料 质粒：大肠杆菌质粒， ， 载体，由 衍生， 公司产品。 ! ! ! 9KL %83M .+,’/ M 9N4%8 MG;GOG ［］ # ，大肠杆菌 链霉菌穿梭质粒，安普霉素抗性对大肠杆菌和链霉菌均有选择作 9;4%%51 3 用，链霉菌的复制子为温敏型，温度高于 不能进行自主复制， 基因在大肠杆菌中 5! P /!,2 Q 国家“九五”科技攻关项目（ ） 1234$%3$3$5 作者简介：陈 芝（ ），女，江苏邳州人，中国农业大学生物学院微生物系博士生，主要从事链霉菌发酵和遗 %16! 7 传学研究。 收稿日期： ，修回日期： $$%3%%35 $$3$%3$8 # 期 陈 芝等：阿维链霉菌中!#$ 基因缺失对阿维菌素合成的影响 #A# 可用于蓝白筛选。 ! !# 菌株：大肠杆菌!# ，阿维链霉菌$%’，均由本室保存。 ! 工具酶：限制性内切酶、 聚合酶、 酶和连接酶购自华美生物工程公司、 ! !$ !*+ ,- 公司、 公司和大连 公司。 ./0 123456, ,7,8, ［］ ! !% 培养基和抗生素：大肠杆菌培养基为9/ % 。阿维链霉菌高渗液体培养基为改良 ［］ :;.;（蔗糖浓度为 # ），原生质体再生培养基为8. $ ，阿维链霉菌固体产孢培养基 ［］ 为 @ ，种子培养基：可溶性淀粉 克，酶母膏 克，大豆蛋白胨 克， · ， :. AB C3CD % E B 46 定容至 。发酵培养基：可溶性淀粉，酵母粉， · ， · ， ， · 9 7 1E A E .6?E $ E C,CE C3CD A 。 培养基中含氨苄青霉素 ，或安普霉素 ，安普霉素也可为 % E 9/ BB 6F49 BB 6F49