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尼妥珠单抗注射液 Nituozhu Dankang Zhusheye Nimotuzumab Injection 本品系由稳定转染可表达人表皮生长因子受体单克隆抗体重组质粒的小鼠骨髓瘤（NS0） 细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后获得的重组人表皮生长因子受体单克隆抗体（尼妥珠 单抗）制成。不含防腐剂和抗生素。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具和动物等应符合 “凡例”的有关要求。 2 制造 2.1 工程细胞 2.1.1 名称及来源 尼妥珠单抗的工程细胞系由编码尼妥珠单抗重链的 pSV2-gpt 质粒和编码轻链的 pSV-hyg 质粒转入NS0 宿主细胞构建而成。 2.1.2 细胞库建立、传代及保存 细胞库建立、传代及保存应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程” 规定。 将细胞种子经无血清培养液驯化，传代、扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细 胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。各级细胞库细胞传代应不超过批 准的代次。各级细胞库的细胞应经检定合格后方可用于生产。 2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定 应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.3.1 支原体检查 依法检查（附录Ⅻ B），应符合规定。 2.1.3.2 抗体表达量测定 细胞库的抗体表达量应不低于5 μg/ml。 2.2 原液 2.2.1 细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，进行传代、扩增，接种细胞培养罐。 2.2.2 生产用细胞培养液 生产用细胞培养液应不含任何血清和抗生素。 2.2.3 细胞培养 采用经批准的工艺进行细胞培养，收集含目的产物的培养液，即为收获液。细胞培养全过 程应严格按照无菌操作。 2.2.4 分离纯化 采用经批准的工艺对收获液进行纯化和病毒灭活，制得高纯度的尼妥珠单抗，除菌过滤后 即为尼妥珠单抗原液。如需存放应规定保存温度和时间。 2.2.5 原液检定 按3.1 项进行。 2.3 半成品 2.3.1 配制与除菌 按经批准的配方配制稀释液，配制后应立即用于稀释。将原液用稀释液稀释至所需浓度， 除菌过滤后即为半成品。 2.3.2 半成品检定 按3.2 项进行 2.4 成品 2.4.1 分批 应符合 “生物制品分批规程”规定。 2.4.2 分装 应符合 “生物制品分装和冻干规程”及附录Ⅰ A 有关规定。 2.4.3 规格 应为经批准的规格。50mg/瓶（10ml）。 2.4.4 包装 应符合 “生物制品包装规程”及附录ⅠA 有关规定。 3 检定 3.1 原液检定 3.1.1 pH 值 应为6.5～7.5 （附录V A ）。 3.1.2 鉴别试验 3.1.2.1 等电点 依法测定（附录Ⅳ D）。等电点图谱应与对照品一致。 3.1.2.2 相对结合活性 照3.1.5.2 项下的方法测定。与空白对照相比，供试品应有明显的相对结合活性。 3.1.2.3 肽图 依法测定 （附录Ⅷ E），肽图图谱应与对照品一致。 供试品经变性、还原和烷基化，按1：50 mg/mg 加入测序级胰蛋白酶（酶切缓冲液：50 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，1mmol/L 氯化钙，1M 尿素，pH 8.1），37±0.5℃保温16 小时， 加入0.1%三氟乙酸终止酶切。上样前每分钟 16000 转离心15 分钟，取上清液作为供试品 溶液。色谱柱以四烷基硅烷键合硅胶为填充剂（如：Vydac C4 柱，25cm×4.6mm，粒度5?m 或其它适宜的色谱柱），柱温为35±0.5℃；流速为0.8ml/分钟；检测波长为 214nm，取供 试品溶液20?l 注入液相色谱仪；按下表进行梯度洗脱（表中流动相A 为0.1%三氟乙酸， 流动相B 为0.1%三氟乙酸－90%乙腈水溶液）。对照品同法操作。 时间 （分钟） 流动相A （%） 流动相B （%） 0 100 0 3 100 0 30 73 27 76 50 50 78 0 100 85 0 100 88 100 0 120 100 0 3.1.2.4 N 端氨基酸序列 （至少每年测定1 次） 用氨基酸序列分析仪或质谱法测定，N 端序列应为： 轻链：Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val 。 重链：pGln-Val-Gln-Leu-Gln-Gln-Ser-Gly-Ala-Glu-Val-Lys-Lys-Pro-Gly 3.1.3 纯度和杂质 3.1.3.1 电泳法 依法测定（附录IV C ）。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为7.5