生物化学论文王文凤.docVIP

安 徽 农 业 大 学 课程论文（高级生物化学） 论文题目 大肠杆菌胞内代谢物提取方法的研究 姓 名 王文凤 学 号 院 系 植物保护学院 专 业 植物病理学 导 师 檀根甲 课程教师 李培金 金青讲 陶芳 范军 中国·合肥 二〇一 五 年 十二 月 大肠杆菌胞内代谢物提取方法的研究 王文凤 植物病理学 摘要：随着各个行业对微生物代谢物的需求量越来越大，因此对微生物代谢物提取的方法有了更多选择，对提取的纯度有了更高的要求。本文通过运用高效液相串联质谱联用技术( LC-MS/M S)对大肠杆菌培养、淬灭、洗涤和代谢产物的萃取等步骤来提取大肠杆菌（JM101）细胞内的代谢物，其中通过重复对比冷甲醇、热乙醇、热甲醇三种提取方法的相对提取率，从相对提取率、重复性等方面综合比较3种提取方法，其中最优方法是冷甲醇法，此方法对大肠杆菌（JM101）代谢物提取的种类和相对提取率都优于另外两种方法。此外， 以冷甲醇法提取的溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明，本方法的代谢物检测线性效果较好，线性范围幅度较宽， 提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。由于实验设备和试剂等条件有限还有一些可用于大肠杆菌（Escherichia coli）代谢物的萃取的方法并没有用于本实验，这方面的研究还有待进一步进行和提高所需实验平台。 关键字： 高效液相色谱-串联质谱 大肠杆菌 代谢物 萃取方法 前言： 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析【1】。近年来在代谢组领域的研究，相对来说得到了较好的发展[2-5]，这些研究所建立的平台，为今后相关方面的研究打好了坚实的基础。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤，一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤【6】。本实验所研究的Escherichia coli( E.coli) 全部代谢物仅占细胞干重的3%-5%，但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系【7】。此次研究对E.coli发酵液进行淬灭、洗涤处理后, 分别运用冷甲醇法、热乙醇法和热甲醇法平行三次提取胞内代谢物 ，在LC-MS/ MS 的多反应检测模式( MRM) 下对目标代谢物进行检测， 由于胞内代谢物数量巨大， 而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用，因此本次实验主要是对磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸类代谢物进行提取相对量的检测和比较。另外，更突出的问题是在使用有机溶剂进行淬灭时，代谢物会从细胞内泄露，这方面原核细胞明显高于真核细胞[8]-[9]。对于代谢物泄露的问题是不能避免的，但是我们选择合适的淬灭溶剂和方法来减少泄露量，以提高实验准确度。 据文献记载仅在大肠杆菌（Escherichia coli）内，就有904代谢物，总共参与932种反应[10-11]，然而这一数目仍在不断增加，对于所有代谢物的分析确实是非常困难的，因此分别选择以上3 类物质中有代表性的8 种代谢物( 共计24 种) 作为考察对象，比较3种提取方法的提取率及重复性。结果表明，冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它两种方法。 一种理想的淬灭、提取方法应符合两个标准：①、经过淬灭、提取后，所获得的代谢物的种类应尽量齐全，损失较小且提取量高②淬灭和提取的过程对细胞内的化学组成产生较小影响，同时不对代谢物造成破坏。一种能够同时且高效获得细胞内所有代谢物的提取方法几乎是不可能的，因为不同代谢物的的化学物质具有不同的极性、溶解度和不同的稳定性。根据上面的描述可以用一种较优异的淬灭、提取方案来满足绝大部分代谢物的生理生化特性，同时还要保证这些物质能成功的从细胞内释放出来而被提取获得且提取率要尽量的高；最后这种方法还要是操作可行性强和简便易得的结果。 为使细胞内的代谢反应立即停止，并尽可能的减少胞内代谢物的外流损失，在取样后要迅速对样品进行淬灭。淬灭操作是使代谢物快速冷却，主要目的是使胞内的酶失活，因而使微生物代谢物的量保持原有状态。淬灭操作要迅速，因为在三羧酸循环中，每秒每升细胞液的ATP代谢流量就有数毫摩尔。淬灭主要是通过快速的pH或者温度变化得以实现的。在淬灭过程中细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏而致使细胞内的代谢物外流，这样的代谢物损失量根据淬灭的方法和时间长短而定。 提取过程主要是加入有机溶剂将所需代谢物与胞内其他物质分开，这一操作过程建立在淬灭的基础之上。微生物胞内代谢物的提取影响因