过氧化物酶.ppt

实验二 过氧化物酶活性的测定 一、实验目的 1.学习红薯过氧化物酶的制备方法。2.掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。 二、实验原理 1、过氧化物酶（简称POD)简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 2．酶活力测定 (1) 酶活力 表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。 (2) 酶促反应速度 酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v表示) 。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时间 常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显。酶促反应随时间增加，产物增加。 若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应的速度曲线。  从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率( v ) = 浓度 / 时间 由于产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量的方法很多： 化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。 物理方法：UV吸收、荧光等。 同位素方法等。 (3) 酶的活力单位 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位(U)。 国际单位(IU)定义：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1微摩尔( μmol)底物的酶量，或是转化1微摩尔底物中的有关基团的酶量。 3、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为： 本实验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在470nm光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收 - 时间的速度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算为酶活力。 2. pH对酶促反应速度的影响 (1) 影响酶促反应速度的因素 * 底物浓度 米氏公式 * 温度 * 酶浓度 * 激活剂、抑制剂 * pH (2) pH对酶促反应速度的影响 大多数酶的活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些基团的解离，这些基团的离子化状态关系到底物与酶的结合、酶的专一性和酶活性中心的构象。通常各种酶只有在一定pH范围内才具有活性，并在一定pH下，酶促反应具有最大反应速度，此pH称最适pH，高于或低于此值反应速度都下降。 如将反应速度对pH作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受pH影响是不同，所以会有不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则是一直线，即受pH影响不大。 不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为pH 8。但应注意最适pH不是特征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物的种类、浓度及缓冲液成份不同而有差异，因此酶的最适pH并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。一般最适pH在6 - 8之间。 由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶活力时，pH必须恒定，所以测活反应最好在缓冲液体系中进行。 本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的时间－光吸收关系曲线，比较三亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力的影响。 三、实验操作 1、过氧化物酶粗品液的制备 ①称取红薯材料1g，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（2ml左右) ，于研钵中研磨成匀