普鲁兰酶基因的隆及其在毕赤酵母中的高效表达.pdf

普鲁兰酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达 摘要 3．2．1．41)是一种能够专“眭切开支链淀粉分支 普鲁兰酶(Pullulanase，EC 点中的n一1，6一糖苷键，从而剪下整个侧支，形成直链淀粉的解支酶。它在淀 粉加工工业中有着非常重要的用途，可大规模地提高淀粉的利用率和牛产效率。 普鲁兰酶可以单独使用，亦可与其它酶配合使用，相辅相成收到良好的效果。当 前较成熟地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和干啤酒生产中。 本论文以Bacillus 中表达了编码普鲁兰酶的基因。同时，通过对重组毕赤酵母发酵条件的优化以及 重组普鲁兰酶粗酶酶学和应用特性的研究，为普鲁兰酶的蛋白质工程提供理论基 础，并为该酶的高效表达和以后的应用奠定基础。 本论文的主要内容有四个部分： 1．Bacillus naganoensis(ATCC53909)普鲁兰酶基因的克隆； 2．普鲁兰酶基因在毕赤酵母中的表达； 3．重组毕赤酵母发酵条件的优化； 4．重组普鲁兰酶粗酶的酶学和应用性质研究。 具体的研究结果和结论如下： 1．以Bacillus Pullulanase基因序列设计引物，成功克隆出了普鲁兰酶基因，序列测定结果表 明与已报道的Pullulanase基因序列完全一致。 I位点，以正确的ORF与酵母 2．将克隆得到的普鲁兰酶基因片段通过EcoR 表达载体pPIC9K上的n一因子信号肽编码序列3’端融合，构建成霞组表达载 l线性化后电击转化表达宿辛 体pPIC9K--Pullulanase。重组酵母表达载体经Sac SMDl 分析表明，普鲁兰酶基因在SMDIl68中得到了正确的表达和修饰，转化子P8 实验室摇瓶发酵时，酶活最高可达350．8U／mL(是出发菌株的约129．9倍)。重 组：[程菌连续传10代后，经接种培养、诱导发酵及PCR反应鉴定表明，P8具 有良好的遗传稳定性。 3．通过对重组毕赤酵母P8发酵过程的两个阶段发酵条件的优化实验，得出 条件下培养48h，接种量为10％。通过正交实验得出诱导阶段的最佳发酵工艺为： 和甘油，在30。C、240rpm条件下诱导培养48h，接种比率为1：1。验证实验表 明，在最佳发酵条件下，P8表达的普鲁兰酶产量平均可达(507．3士2．8)U／mL。 4．基因工程菌P8所产普鲁兰酶的分子量约为119．9kDa：最适作用温度范围 范围内，该酶都具有较高的活性；该酶具有很好的热稳定性，60。C保温64h仍有 45％的残余酶活，耐热性较原始菌株有所提高。该普鲁兰酶反应不需要金属离子 对浚酶都有不同程度的抑制作用；添加M92+和Ni2十对酶活性有不同程度的促进 103mol／L的SDS使酶完全失活，这可能是由于该普鲁兰酶分予中缺乏二硫桥结 构的缘故。 以上研究结果表明，本研究构建的基因工程菌所产的普鲁兰酶表达鼍较高， 实验室摇瓶发酵时，酶活可达350．8U／mL；其粗酶的酶学和应用性质得到了进一 步研究，证明工程菌所产普鲁兰酶具有较好的耐酸、耐热性；通过对发酵条件进 行优化，最佳发酵条件下的普鲁兰酶产量平均可达(507．3士2．8)U／mL。因此，浚株 基因_]：程菌所产的普鲁兰酶具有广阔的工业化生产和应用前景。 关键词：普鲁兰酶；Bacillus 酵母；发酵条件优化：酶学性质及应用特性 CLoNINGAND oVEREXPRESSIONOFGENE ENCoDINGTHEPULLULANASE FROMBacillus ABSTRACT Pullulanase(pullulan一6一glucanohydrolase，EC3．2．1．41)is considereda usually that cleaves debranchingenzymespecificallyd一1，6