11基因组和比较基因组学.ppt

11 基因组与比较基因组学 11.1 高通量DNA序列分析技术 11.2 人类基因组计划 11.3 其他基因组 11.4 比较基因组学及相关研究 20世纪人类科技发展史上的三大创举： 1940年代第一颗原子弹爆炸； 1960年代人类首次登上月球； 1990年代提出并已基本完成的人类基因组计划（HGP）。 基因组学是美国人T·H·Rodehck在1986年7月提出来的。 基因组是生物体内遗传信息的集合，是某个特定物种细胞内全部DNA分子的总和。 原核生物基因组：原核生物DNA分布在整个细胞之中，有时相对集中在类核体上。类核体上的DNA是一条共价、闭合双链分子，类核体通常也称为染色体。这条染色体的DNA就是原核细胞的基因组。 真核生物基因组：一个物种的单倍体的各条染色体中的全部DNA为该物种的基因组（genome）。例如，人有23对染色体，配子——单倍体是23条染色体，这23条染色体中的全部DNA就是人体基因组。 11.1 高通量DNA序列分析技术 1. DNA序列测定的基本原理 DNA自动测序仪可快速测定DNA序列，计算机处理能力的快速提高则使得大量DNA小片段很容易拼接成较大的片段甚至整个染色体。 高效快捷的DNA测序方法是20世纪70年代中期发展起来的，主要有两种：Sanger的双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert的化学修饰法。 Sanger 的双脱氧链终止法 基本原理： 核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’端的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 Maxam-Gilbert化学修饰法：1）基本原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。2）基本步骤：（1）同位素标记DNA片段的5’端；（2）在特殊位置上通过化学反应随机打断DNA链G,A(some G),T(some C)，C；（3）形成大小不一的DNA链；（4）电泳分离DNA链；（5）根据同位素标记自显影后读出序列。3）优点：不存在因DNA序列或结构引起DNA合成问题，能测定用酶学方法不能正常测序的DNA序列。4）缺点：需使用剧毒化学试剂。 DNA测序自动化：1）使用荧光标记的dNTP；2）毛细管电泳；3）激光检测读序。PCR用于制备测序反应：1）测序反应实质就是DNA扩增，因而可以用PCR进行测序反应。2）与典型PCR反应的不同：（1）只用一个引物；（2）需用测序级的DNA聚合酶；（3）DNA模板量高，一般0.5-1.0mg；（3）循环次数多，一般35-40个循环；（4）产物需纯化干燥。实际工作中如要进行DNA测序，需要准备什么？1）克隆你的目的基因或其片段；2）鉴定你所得到的含目的基因或片段的重组质粒；3）将含重组质粒的细菌或质粒送测序公司；4）等结果。 2. 基因组DNA大片段文库的构建 构建基因文库是测序前必须的预备工作。酵母人工染色体技术（YAC）为创制基因组物理图提供了极大的方便。ARS序列（Ori），CEN序列，TEL序列。 YAC的主要缺点： 1）存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；2）部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；3）难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构。4）操作时容易发生染色体机械切割。 用细菌的F质粒及其调控基因构建了细菌染色体克隆载体BAC，其克隆能力在125-150kb左右。质粒主要包括oriS， repE（控制F质粒复制）和parA、 parB（控制拷贝数）等成分。以BAC为基础的克隆载体转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化。 3. 鸟枪法基因组序列分析技术 DNA序列分析技术一次测序反应的长度不能超过1kb，不能直接用BAC等大片段作为序列分析的模板，采用全基因组鸟枪法测序技术——随机挑选插入基因组DNA的质粒做测序反应，然后用计算机程序进行序列拼接。 采用全基因组鸟枪法测序的基本原理： 对某基因组文库全部克隆片段进行末端序列测定中未测到的碱基数，即缺口(gap)，与已测定的总碱基数相关。 随着已测定碱基数的增加，缺口的总碱基数目会按照泊松公式的一个推论（P=e-m）迅速减小。其中P为基因组中某个碱基未被测