单链抗体在大肠杆菌的可溶性表达及GPX模拟酶对心肌细胞的抗氧化作用.pdfVIP

吉林省第三届科学技术学术年会 897 单链抗体在大肠杆菌的可溶性表达 及GPX模拟酶对心肌细胞的抗氧化作用 王 楠 牟 颖 孙 晔 吕绍武 闫岗林 罗贵民 (吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室长春 130023) 1．11．1 摘要：谷胱甘肽过氧化物酶(EC 9，GPX)是抗氧化酶系的重要一员，为了实现单链抗体的 S)中，使其分泌到大肠杆菌的周质腔中得以表达，获得了可溶性表达产物。产物经 前导肽，转入BL21(1ys 过分离纯化、Western U／ Ixmol。通过脂质过氧化、细胞存活率和细胞膜通透性实验研究表明，具有GPX活性的单链抗体对大鼠乳 鼠心肌细胞有抗氧化损伤的作用，是膜脂质过氧化的有效抑制剂。 关键词：谷胱甘肽过氧化物酶 单链抗体 可溶性表达抗氧化 现代医学研究表明，人类的许多疾病如脑出血、肿瘤、白内障和克山病等的发病机理都与氧自由基的 形成密切相关。生物体自身存在一系列的抗氧化物酶，它能消除体内代谢过程中产生的过氧化物。其中较 具代表性的为含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，它在分子水平上相对其它抗氧化物酶具有较高的生理 拟物在日本已进入了三期临床的试用阶段”-61。但它仍存在GPX活力低和水相中的溶解性差等缺点。针 体，利用基因工程原理构建了pTMF一2F3工程菌，表达产物经化学诱变引入催化基团获得具有天然GPX 酶活力的单链抗体”j。原有的表达载体pTMF在大肠杆菌中的表达产物为包涵体形式，但由于表达产物为 包涵体形式，包涵体的复性效率极低，使其在今后的研究应用带来很大的困扰。本文采用新的表达载体 pPelB，在目的基因的N端连有前导肽序列，实现了单链抗体在大肠杆菌中的可溶性表达，为具有GPX活 力的单链抗体的实际应用开辟了新的发展前景。 1 材料和方法 J．1 材料 1．1 1质粒和菌种 S)菌种为美国密执安州立 pTMF质粒为中国科学院遗传所黄华梁教授惠赠，pPelB质粒和BL21(Lys 大学隋德新博士惠赠。 1 1 2 酶与试剂 Pharmacia (IPTG)购自上海生物工程公司，分离纯化介质购自AmershamBiotech公司，寡核苷酸由上海生 Molecular 物工程公司合成并纯化，DNA测序由北京赛百胜生物工程公司完成，抗H。s抗体购自Roche 898 振兴吉林老工业基地——科技工作者的历史责任 司，胰蛋白酶购自Difco公司。 1 2 方法 1．2．1 目的基因的表达及纯化 重组质粒转化于大肠杆菌BL21(LysS)，挑单斑于LB培养基(A。P。。。，Chl。)中，37℃培养i2h，以 1．2％(体积分数)接菌量接种于LB培养基中振荡培养，采用正交实验方法。选择培养温度、诱导剂浓度、 mmol，OD值为0．6、0．9，培养时间3h、4h，综上指标为目的蛋白占菌体总蛋白的百分比。离心后收集菌 体。菌体重悬于20mmolPBS，pH7．4溶液中，一70℃冻存。融化，冰浴下超声破碎，收集上清液，进行SDS- Fast PAGE分析。上清液上CM—Sephamse SDS—PAGE和Western—Blot检验。 1．2．2单链抗体样品纯度 以凝胶成像定量分析方法测定。 1．2．3 Western-Blot印迹检验 移至硝酸纤维素膜上，采用TTBS(0 联标记的革抗鼠抗体，TMB溶液显色。 1．2．4化学诱变硒化测活 h．无氧条件下加入摩 蛋白样品加入摩尔比为1：100的PMSF(10mg／mL乙腈)溶液，37℃