细胞生物学设计性试验.doc

重金属Cu2+对豆芽遗传物质的影响 摘要： 以黄豆豆芽为供试材料,以不同浓度的Cu2+为受检物质, 采用实验分析与 统计分析的方法，探讨Cu2+对黄豆豆芽细胞的微核效应。 关键词：Cu2+;重金属；遗传物质;微核率 微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体 ,染色同主核 ,其直径一般为主核的 1 /3～1 /2, 主要由外界损害因素 (生物、物理、化学 )作用细胞后 , 导致细胞染色体丢失或断裂 , 从而在胞浆中形成 1个或数个小核。多种实验已经证实 ,微核率的大小和作用因子的剂量有一定的关系[1]。故常用微核来检测各种理化因子对生物体潜在的遗传危害。 蚕豆根尖微核试验在1986年已被中国环保局列为一种环境生物测试的规范方法，它作为一种环境变异的检测手段，在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，并建议在全世界范围内推广。环境的三致性，即指环境对生物的致畸、致癌、致突变性，是目前环境污染中最主要的问题。三致的根本在于致突变，致畸、致癌常常是致突变的结果。 微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的1／20－1／5，这就是微核（micronucleus）。微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比E. haichowensis 在低浓度Cu污染的环境下（250μ mol/l），Cu似乎对种子萌发有一定的刺激作用，但是当浓度超过750μ mol/l时，萌发率就随着Cu浓度的增加而降低了，当浓度增至2000μmol/l时，萌发率则低于40%，与对照相比降低了一半[3]。设计相应的五个浓度梯度Cu处理，并设计一个用蒸馏水处理的对照实验组。 二、实验材料：? 1．器材? 光学显微镜、10ml试管、发芽盒、洗瓶、镊子、载玻片、盖玻片、滤纸。 2．材料?种子 ．mol/l、3mmol/l、1.5mmol/l、0.75mmol/l、0.375mmol/l） 卡诺氏固定液：由3：1的乙醇和冰醋酸配制； 水解分离液：盐酸与酒精1：1混合； 改良苯酚品红染液?? 三、实验步骤： 1种子处理 种子洗净后室温下用蒸馏水浸泡发芽24小时，然后移入铺有纱布的托盘内培养。当初生根长到2cm时，取发育良好的，大小与根长近似的幼根。将选好的豆芽放入发芽盒中，使根尖完全浸入处理水样中，室温下培养48小时后，用蒸馏水洗根尖2次，24小时，设蒸馏水处理为空白对照。借助于卡诺氏固定液的作用，迅速透入组织和细胞将之杀死，并且使其结构和内含物如：蛋白质，脂肪，糖类以及核物质与细胞器等，在形态结构上尽可能保持生活时的完整和真实状态，同时更易于染色，可以较清楚的显现细胞在生活时不易看清的结构。 固定时在10ml试管内放入卡诺氏固定液约5毫升，用刀片或小剪刀切取经过处理的长约0.5—1厘米的根尖—10条，放入试管内，用塞盖紧，在室温下固定2—24小时  3、水解分离 ??? ???水解分离的作用是去除未固定的蛋白质,?同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散而易于观察。取处理好的材料，放在试管内加水解分离液2毫升，室温下处理8—20分钟，倒去水解分离液，再加入固定液2毫升，进行软化5min，软化对细胞壁起腐蚀作用。然后倒去固定液，用蒸馏水反复冲洗使材料呈白色微透明，以镊子柄能轻压碎好。 改良苯酚品红染色法：切取根尖分身组织放在载玻片上纵横切成几段，放在载玻片上，覆以载玻片，用镊子柄或铅笔头轻敲几下，再用拇指用力下压，注意不要使玻片移动，分开两玻片，滴上1—2滴染液，20—30?分钟后加上盖玻片，注意不要有气泡产生，用吸水纸吸去多余染液。 1 2 3 4 5 6 出现微核细胞数 细胞总数 四．实验结果 预计结果 用蒸馏水处理的豆芽根尖细胞正常。用较高浓度硫酸铜处理的出现微核现象，且随着浓度的升高，微核率变高。结果记录表格： 浓度（mmol/l） 蒸馏水 6 3 1.5 0.75 0.375 出现微核数 细胞总数 微核率 实际结果 由于多种原因，实验结果不理想，我们并没有观察到微核现象，可观察到： 改良苯酚品红 浓度为3mmol/l CuSO4处理豆芽的结果 浓度为1.5mmol/l CuSO4处理豆芽的结果： 浓度为0.75mmol/l CuSO4处理豆芽的结果： 浓度为0.375mmol/l CuSO4处理豆芽的结果： 蒸馏