蚕蛹蛋白复合氨基酸的提取及其体外抗肝癌作用的研究.pdf

摘 要 捅 要 目的探讨蚕蛹蛋白、蚕蛹蛋白复合氨基酸的最佳提取条件，并研究蚕蛹蛋白复 合氨基酸在体外对人肝癌细胞的抑制作用。 方法以柞蚕蛹为原料，石油醚为脱脂溶剂，采用碱溶液浸提法提取蚕蛹蛋白， 运用单因素试验对固液比、浸提时间、温度3个提取条件进行优选。提取出的蚕 蛹蛋白经双氧水进行脱色、除臭，得到黄色无臭味蚕蛹蛋白粉，采用凯氏定氮法 测定蛋白的含量。将蚕蛹蛋白用胃蛋白酶水解后再经酸水解来制取蚕蛹蛋白复合 氨基酸。通过单因素试验探讨了酶水解时的底物浓度、pH值、酶浓度、水解温度 及水解时间与水解率的关系，采用正交试验L16(45)优选酶水解的工艺条件。经减 压蒸馏、中和、脱色等处理得到黄色澄清的蚕蛹蛋白复合氨基酸。以SMMC．7721 细胞株为模型，研究蚕蛹蛋白复合氨基酸体外对人肝癌细胞的抑制作用。经MTT 法检测药物对人正常肝脏细胞株QSG．7701的毒性后，计算药物安全浓度。将蚕 蛹蛋白复合氨基酸配制成浓度为10d medml和 mg／ml、10五mg／mi、10～medml、1 10medml，分别与人肝癌细胞SMMC．7721共同培养，同时设空白对照组和细胞 ul， 对照组。每组设5个复孔，每孔加入细胞浓度为4X104个枷的细胞悬液100 分别培养24、48、72h。采用MTT法测定OD值，评定蚕蛹蛋白复合氨基酸对肝 癌细胞株的抑制作用；经Hoechst33258(10 rag／L)染色和倒置显微镜进行形态学 WPI双染色法检测 观察以检测细胞凋亡率；流式细胞法测定细胞周期和Annexin 细胞凋亡。 结果以石油醚为脱脂溶剂，提取蚕蛹蛋白的脱脂条件为固液比1：4，温度50℃， 时间4h。重复4次，脱脂率达到96％以上，所得蛋白粉的蛋白含量为83．5％，蛋白 回收率为32．59％。胃蛋白酶水解蚕蛹蛋白的最佳酶解工艺条件为：底物浓度为1：5， h。酶解后再经盐酸水解，其水 pH值4．0，酶浓度1．5％，水解温度60℃，水解时间5 解率可达到70％左右。所得溶液中氨基酸总量为2．241g／L，其中必需氨基酸含量为 0．835 e,／L，占氨基酸总量的37．26％。细胞毒性实验表明：蚕蛹蛋白复合氨基酸的 最大无毒浓度为10mg／ml。不同浓度的蚕蛹蛋白复合氨基酸作用SMMC一7721细胞 24、48和72h后，各用药组的细胞生长抑制率分别为9．0％53．5％、12．4％《3．4％和 16．80／0．．．70．4％。各组与细胞对照组相比，OD值的差异有显著性(尸n酊)，并显 示出对剂量和时间的依赖性。作用24、48、72h后，蚕蛹蛋白复合氨基酸对 mg／rra。 SMMC一7721细胞的IC50分别为4．691mg／ml和0．451 m咖l、1．469 Hoechst33258(10 me／L)染色和流式细胞术结果表明，随着剂量的加大，蚕蛹蛋 摘 要 自复合氨基酸能明显促进SMMC．7721细胞的凋亡。 结论蚕蛹蛋白主要是球蛋白，部分溶于水和稀酸中，在碱性溶液中溶解度最大， 故碱性溶液浸提法提取蚕蛹蛋白能有效的提高蛋白得率。运用酶水解与酸水解相 结合的方法来水解蛋白，同时具有了酶法的所需条件温和，酶用量少，氨基酸破 坏少和酸水解法的水解彻底等特点，所得复合氨基酸中氨基酸种类齐全，必须氨 基酸在体外对SMMC．7721细胞株有一定的抑制作用。蚕蛹蛋白复合氨基酸毒性 较小，具有良好的运用前景。 图12表12 参55 关键词蚕蛹蛋白；蚕蛹蛋白复合氨基酸；胃蛋白酶；正交试验； SMMC．7721 细胞；细胞周期；细胞凋亡 分类号：R735．7