必威体育精装版(检本)第七章荧光免疫技术.ppt

检验学院 何 涛 教学目的要求： 掌握免疫荧光显微镜技术 掌握时间分辨荧光免疫技术 了解荧光免疫测定的临床应用 1、概述　　荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。 近年来，随着科学技术的发展，一系列新的仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切片或细胞表面的抗原，扩大到进行活细胞分类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被广泛应用于临床检测和科学研究。 2、技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。 ⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法 第一节　荧光免疫技术的特点 荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光（fluorescence）。 一、荧光的基本知识 （一）发射光谱 指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。 （二） 激发光谱 指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 （四）荧光寿命 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。 （五）荧光的淬灭 荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退成为荧光淬灭。例如紫外线照射、高温、苯胺、硝基苯、酚、I-等。 （六）荧光偏振 第二节 荧光抗体的制备 一、抗体要求 二、荧光素要求 三、荧光素标记抗体的方法 四、荧光素标记抗体的纯化 五、荧光抗体的鉴定 六、荧光抗体的保存 第三节　免疫荧光显微技术 免疫荧光显微技术的基本原理是：荧光抗体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去未结合的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质进行鉴定。 常见的临床标本有：组织、细胞和细菌三大类，可分别制成切片、印片和涂片。 组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用） 印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细胞HEP-2) 试验类型 1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色。 返回 荧光抗体染色结果判断 设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型 “-”：无或仅见极微弱荧光。 “+”：荧光较弱但清楚可见。 “++”：荧光明亮。 “+++”：耀眼强荧光。 特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。 根据呈+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 三、荧光显微镜检查 利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。 经荧光抗体染色的标本，需要在荧光微镜下观察。一般要求染色后立刻镜检，以防荧光消褪，造成假阴性结果。 荧光显微镜的基本结构 光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片：隔热、激发和吸收滤光片 光路：透射光、落射光 聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器 镜头：消色差镜头 返回 隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。 透射荧光显微镜光路(a) 落射荧光显微镜光路(b) 透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。 第四节 荧光免疫分析 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定 时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA) 基本原理：是用镧系稀土元素螯合物（如Eu3+）标记抗体或抗原，检测标本中的抗原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，得用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。 时间分辨检测原理示意图 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 时间分辨荧光免疫测定