必威体育精装版基因工程8.ppt

第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 §1 基因组DNA文库的构建 §2 cDNA文库的构建 §3 基因克隆的筛选策略 外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因。 目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。 对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。 为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。 1 基因文库(gene library)概念 又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 2 构建基因文库的基本程序 1)提取研究对象基因组DNA，制备合适大小的DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA； 2) DNA片段或cDNA片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA； 3)重组DNA转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌； 4)阳性重组菌落或噬菌斑的选择。 目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆 3 基因文库的分类 按照外源DNA片段的来源： 从特定组织提取的染色体基因组DNA---基因组DNA文库 mRNA反转录成的cDNA拷贝----cDNA文库 用于基因克隆的DNA材料的选择： 如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来； 如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。 1)基因组文库 (Genomic library) ： 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目 的是分离有用的目的基因 和保存某种生物的全部基因。 2)cDNA文库 (cDNA library) ： 是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。 cDNA(complementary DNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。 第一节 基因组DNA文库的构建 一、基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。 二、基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选 三、基因组DNA文库构建的程序 ①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤重组克隆的挑选和保存。 四、原核生物基因组DNA文库的构建 （一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂 （二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024 2