必威体育精装版基因工程概论.ppt

基因工程的基本概念 A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 D 基因工程的基本形式 D 基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 D 基因工程的支撑技术 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的主要类型： 插入灭活型载体 Charon2、Charon6、lgt11 取代型载体 lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40 正选择型载体 lEMBL1、lL47、l1059 野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+）， 这种生长抑制表型受l-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外 源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌 体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA重组分子的体外包装： l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA及其重组分子的分离纯化： 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒 密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放l-DNA 乙醇或异丙醇沉淀l-DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA作为载体的优点： l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 l-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量 重组l-DNA分子的筛选较为方便 重组l-DNA分子的提取较为简便 l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 生物结构 M13噬菌体的外型呈丝状 M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因 2700个VIII M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 III VI VII XI 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13噬菌体的生物学特性： 感染周期 + DNA （+）DNA RFDNA RFDNA RFDNA - DNA II V 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13 DNA载体的构建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13RF-DNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列载体 lacZ‘ polylinker 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA M13 DNA载体的特点： 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混 浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊 斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb 噬菌体或病毒DNA 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病 毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病 毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： 单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒 RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物， 这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。 考斯质粒与噬菌粒 l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25 kb和 1.5 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片