必威体育精装版基因工程载体.ppt

第四章 基因工程载体 §1 概述 §2 克隆载体 §3 大肠杆菌表达载体 第一节 概述 载体（vector）是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。 按功能:克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 按工作方式:质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体等。 按受体细胞:原核细胞载体和真核细胞载体。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 第二节　克隆载体 克隆载体(cloning vector)：是指用于扩增或保存外源DNA片段而设计的载体。 克隆载体的结构特征 克隆载体具备的条件 ①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。 ②载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。 ③载体都具有合适的遗传标记基因。 ④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。 ⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。 ⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。 ⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。 ⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。 一、质粒载体 质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的克隆载体,主要用于原核生物和动植物的基因转移以及建立基因文库和cDNA文库。 2.质粒的生物学特性 (1)质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态,但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体地复制而复制。 (2)质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后,可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 3.质粒载体的发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 4.标记基因 标记基因按其用途分为2类： 选择标记基因:用于鉴别目的载体的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。 筛选标记基因:用于区别重组质粒与非重组质粒，可将携带了外源DNA片段的重组质粒挑选出来。 4.2 筛选标记基因 (1)α-互补(α-complementation) 是指β-半乳糖苷酶基因(LacZ)上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的LacZ基因的突变体之间实现互补，从而产生具有β-半乳糖苷酶学活性的蛋白，这种现象就称为α-互补。 5.3 pUC质粒系列 pUC质粒在pBR322基础上改建的，其组成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌?-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码?-肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。 pUC质粒载体的优点： 具有较小的相对分子质量和更高的拷贝数，平均每个细胞可达500-700个拷贝。 适用于组织化学方法检测重组体,有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的?-肽链可参与?-互补作用，在IPTG诱导和底物X-gal存在下，形成蓝色和白色菌落筛选重组体。 具有MCS区段，便于具有不同粘性末端的外源基因的插入。 6 质粒克隆载体的用途 用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。 构建基因组文库和cDNA文库。 可用于目的基因的测序。 作为核酸杂交时探针的来源。 λ噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。 λ噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 λ噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原。 λ噬菌体DNA的两个5′末端为12bp的单链，两端序列