必威体育精装版感受态制备蓝白斑筛选.ppt

* * 此处可以做一个图啊，三种方式：质粒到细菌；噬菌体到细菌；病毒到动物细胞。三种载体均含有外源DNA。 感受态细胞的制备 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选 复习：基因克隆示意图 基因克隆操作过程： 分 分离载体和目的基因 切 限制酶切载体与目的基因 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 基因工程 一、感受态细胞及重组体转化 重组体转入受体菌 受体细胞 转化（transformation） 转染（transfection） 转导（transduction） 转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。 转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞; 转导则是指病毒从被感染的细胞(供体)释放出来，再 次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重组。 重组DNA分子导入受体细胞的手段 转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性改变 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 感受态(competent)：宿主细胞处于容易吸收外源性DNA的状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞. 正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增大，处于感受态。 制备感受态细胞和转化的常用方法 CaCl2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5?106－2?107转化子/?g质粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体(liposome)法、胞核的显微注射法(microinjection)； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法； CaCl2法制备感受态细胞和转化的原理 一般受体菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。当细菌处于冰冷（0℃）0.05～0.1M的 CaCl2低渗溶液中，菌体的细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对DNA的摄取能力增强，转化效率提高（感受态细菌）。 同时在转化体系中的DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复合物能粘附于细菌表面，经过42℃短时间热休克（heat shock）处理，促进感受态细胞吸收DNA复合物。在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培养(selective culture)平板上即可筛选出所需的转化子。 0.1mol/LCaCl2 0℃ 重组体 感受态细胞 转化(transformation)：在分子克隆技术中，转化特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 区别转化、转染(transfection)与转导(transduction) 转化与感受态细胞 二、感受态细胞制备及重组体转化的实验操作及注意事项 细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP管，40C，4000rpm×5min 弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 300μl，重悬菌体，冰浴20min 40C，4000rpm×5min 弃上清，将管倒置于滤纸上1min，使液体流干净 ?沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl2 100μl，重悬菌体。 ? 冰浴10min 冰浴10min后 每管加入质粒5?l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴，冷却1~2min 取出试管后，每管加入LB培养基800?l， ? 置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min ? 用无菌弯头玻璃铺菌器将200?l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面? 室温放置20min，使液体被吸收（发汗） ? 倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长 三、重组体的筛选 重组体克隆的筛选与鉴定 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法得到含有重组DNA的阳性克隆。 筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法： 抗药性标志的选择 插入表达筛选 ?-半乳糖苷酶系统筛选（?-互补） (?-半乳糖苷酶能将X-gal转变为不溶性的深蓝沉淀） (插入失活法) 抗药性标记选择 目 录