必威体育精装版感染性疾病分子诊断.ppt

分子诊断学 结核分枝杆菌 结核分枝杆菌1882年由Robert Koch发现，对人致病的主要是人型结核分枝杆菌，引起结核病。伴随艾滋病的流行、免疫抑制剂的应用等，结核病发病率逐年上升，免疫低下个体特别是HIV感染者更易于感染结核分枝杆菌。尽管存在有效短程化学疗法和卡介苗接种等方法防治，TB仍然是威胁人类生命最严重的感染性病原。1993年，WHO宣布结核病是一个全球性危机。 结核病的历史 态生两靥之愁 娇袭一身之病 结核杆菌 1、直接涂片镜检 2、浓缩集菌 3、分离培养 分子生物学快速诊断 病原菌的诊断方法有直接涂片镜检、分离培养、生化试验、血清学试验和动物试验等，但由于细菌培养周期较长等种种原因，尚不能令人满意。分子诊断技术的应用将使细菌感染的诊断出现一个质的飞跃，同时可将分子诊断技术用于细菌分型、耐药性的检测中。 一、淋球菌 淋球菌(gonococcus)又名淋病耐瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae, NG)，是淋病的病原菌。 （一）细菌基因组结构 淋球菌染色体可编码约5000个基因，仅为大肠埃希菌基因组的1/3，其G+C含量为52%。 （二）分子诊断方法 1. PCR 2. LCR 可采用连接酶链式反应(ligase chain reaction, LCR)检测淋球菌DNA。 （三）临床意义 1. 对分离培养的菌株进行鉴定和进一步分析。 2. 用于抗生素治疗的疗效观察及监控。 3. 提高临床标本检测的阳性率和准确性。 4. 对淋球菌菌株进行分子流行病学分析。 5. 对疑为淋球菌引起的疾病的诊断和鉴别诊断具有决定性作用。 目前临床上常用的结核病诊断方法有细菌学涂片抗酸染色、活检病理诊断和体液或组织培养。 细菌学涂片和活检病理抗酸染色找到抗酸杆菌可以确诊结核，但是阳性率很低，而且不能区别结核杆菌和不典型结核杆菌。另外麻风杆菌也可以表现为抗酸染色阳性。体液或活检组织的分枝杆菌培养阳性可明确诊断结核及菌型，但是培养时间长，且阳性率非常低。虽然新的培养法BACTEC 法显著缩短了培养、菌型鉴定结果的报告时间，但由于该法使用放射性底物而使它的应用受到了限制。并且有些类型分枝杆菌不能在培养基中生长。 结核病2006年全世界流行分布情况 1882年3月24日，罗伯特.科赫（ Robert Koch ）宣布发现结核杆菌-----世界防治结核病日 结核杆菌 结核分枝杆菌(M.tuberculosis) 生物学主要特点： 1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质 2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿 3.抗酸染色阳性 抵抗力 四 怕 乙醇 湿热 紫外线 抗结核药物 四不怕 干燥 酸碱 碱性染料 青霉素等抗生素 致 病： 致病物质　 　脂质①索状因子 ②磷脂 ③硫酸脑苷脂(sulfatide) ④蜡质D 蛋白质 多糖 感染方式 呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体 所致疾病 疾病种类多样化 以肺结核为主 传统的微生物检查 传统的微生物检查 传统的微生物检查 基因结构 分子诊断 临床意义 TB H37Rv株的基因组为环形DNA。 0点表示复制起始点。 最外层代表稳定的RNA基因和直接重复区 第二层示线性编码序列 第三层描述了重复DNA 第四环标出了PPE家族的位置 第五个环标出了PE家族的位置 第六个环标出了PGRSs序列的位置 最中心的直方图表示了G+C含量 基因结构 可采用PCR、FQ-PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR等方法检测标本中的TB DNA。 PCR扩增所选靶序列主要有65000抗原基因、MPB蛋白基因、tRNA基因、TBIS110插入序列、染色体DNA的重复序列等。 扩增产物可用核酸杂交法进一步鉴定产物的特异性。 PCR 分子诊断 应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物. 另外几个关键因素是: ①DNA提取 ②TaqDNA聚合酶的活性 ③PCR产物的检测方法 具体 步骤 分子诊断 （一）病毒基因组结构 丙型肝炎病毒呈球形颗粒，直径约50nm，有一脂质包膜。核心含单股正链RNA，长9.4 kb。整个基因组只有一个可读框，位于基因组中央，编码一条含有 RNA病毒中的RNA能自我复制，大部分RNA病毒是单链的，复制一般是先以自己为模板合成一条互补的单链，病毒原有的、起模板作用的链称为正链，新复制的RNA链称为负链。 （二）分子诊断方法 1．PCR 2. 核酸杂交 3. bDNA技术 4. 基因芯片技术 1. 定性检测 虽然抗H